黃芩苷對大鼠結(jié)腸成纖維細胞增殖及TGF-β1、CTGF表達的影響

婁石磊，苗永迪，豈 蕊，治丁銘，孫 聰

（長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117）

腸纖維化是克羅恩病（CD）、潰瘍性結(jié)腸炎（UC）和輻射性腸炎等多種炎癥性腸病（IBD）的并發(fā)癥之一。其病因主要由腸道炎癥損傷修復(fù)失調(diào)和腸間質(zhì)細胞過度增殖，進而導(dǎo)致大量的細胞外基質(zhì)（ECM）沉積于腸壁，產(chǎn)生腸道纖維化、腸道狹窄和腸梗阻等嚴重后果[1-2]。隨著腸纖維化研究的不斷深入，成纖維細胞的功能及相應(yīng)的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制研究已經(jīng)成為重點。黃芩苷（baicailin，C21H18011），是從唇形科植物黃芩（scutellaria baicalensis georgi）的干燥根中提取的一種黃酮類化合物。近年來，動物實驗和臨床研究均證實，黃芩苷具有抗纖維化及器官保護作用[3-5]。本課題組采用MTT法、ELISA和Western blotting等技術(shù)，研究黃芩苷對體外結(jié)腸成纖維細胞增殖影響和相關(guān)蛋白表達水平的變化，探究其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、藥品及主要試劑 大鼠結(jié)腸成纖維細胞，由長春中醫(yī)藥大學(xué)生物化學(xué)實驗室提供。黃芩苷由中國獸醫(yī)藥品檢查所提供，批號Z0271504。地塞米松磷酸鈉由中國藥品生物制品檢定所提供，批號2Q3W-614V。高糖DMED干粉（美國Gibco公司），胎牛血清（上海依科賽生物公司），胰蛋白酶1：250（美國GenView公司），噻唑藍（美國GenView公司），二甲基亞砜（北京索萊寶生物公司），Rat TGF-β1（LAP）Uncoated ELISA Kit（美國 Invitrogen公司），TGF-β1 polyclonal antibody和CTGF polyclonal antibody（ 美 國Bioworld公司）。

1.2 細胞培養(yǎng) 大鼠結(jié)腸成纖維細胞37 ℃水浴復(fù)蘇，置于含有20%胎牛血清（FBS）、1×105u / L青霉素和1×105u /L鏈霉素DMEM培養(yǎng)基種，放入37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定時觀察細胞生長情況[6]。

1.3 MTT法檢測細胞增殖抑制率 取對數(shù)生長期結(jié)腸成纖維細胞，0.25%胰蛋白酶消化，充分吹打成單細胞懸液，每孔200 μL接種于96孔板中。貼壁生長24 h后，分別加入含有 25、50、100、200、400、800 μmol/L 黃芩苷的培養(yǎng)基，以不含藥培養(yǎng)基作空白對照（每組設(shè)7個復(fù)孔）。置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入20 μL MTT，37 ℃孵育4 h。吸去96孔板中液體，每孔再加入150 μL DMSO，室溫震蕩溶解細胞中的紫色結(jié)晶，490 nm測吸光度值，計算細胞的增殖抑制率（%）=（1-實驗組吸光值/空白對照組吸光值）×100%[7-8]。

1.4 ELISA檢測細胞培養(yǎng)基上清中TGF-β1含量 取對數(shù)生長期結(jié)腸成纖維細胞，接種于細胞培養(yǎng)板中，待細胞生長至70%融合狀態(tài)加入不含血清DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h作同步化處理。將結(jié)腸成纖維細胞分為5組，空白對照組加入正常培養(yǎng)基，陽性對照組加入含10 mmol/L地塞米松磷酸鈉培養(yǎng)基，中藥高、中、低濃度組分別加入含30、150、750 μmol /L黃芩苷培養(yǎng)基。CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，取細胞培養(yǎng)基上清液，2 000 r/min離心5 min去除細胞碎片及其他雜質(zhì)。用ELISA試劑盒測定標準品及待測樣品的吸光度值，根據(jù)標準曲線計算各組上清液中TGF-β1含量[9-10]。

1.5 Western blotting檢測結(jié)腸成纖維細胞中TGF-β1和CTGF表達水平 1）取對數(shù)生長期結(jié)腸成纖維細胞，接種于細胞培養(yǎng)板中，待細胞生長至70%融合狀態(tài)加入不含血清DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h作同步化處理。將結(jié)腸成纖維細胞分為5組，空白對照組加入正常培養(yǎng)基，陽性對照組加入含10 mmol/L地塞米松磷酸鈉培養(yǎng)基，中藥高、中、低濃度組分別加入含30、150、750 μmol /L黃芩苷培養(yǎng)基。2）棄去培養(yǎng)基，PBS清洗細胞2～3次， 0.25%胰蛋白酶消化并收集細胞，1 000 r/min離心5 min去除胰蛋白酶保留細胞。細胞沉淀中加入200 μL RIPA細胞裂解液渦旋混勻，冰水浴充分裂解1 h。4 ℃，12 000 r/min離心2 min去除細胞碎片及雜質(zhì)，加入5×蛋白上樣緩沖液100 ℃煮沸10 min，冷卻后- 20 ℃保存[11]。3）使用超微量紫外-可見光分光光度計測量各組細胞中總蛋白濃度；配制SDS聚丙烯酰胺凝膠，每孔上樣100 μg蛋白樣品，100 V恒壓垂直電泳1.5～2 h；300 mA恒流轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂奶粉封閉3 h，加入一抗4 ℃孵育過夜；TBST緩沖液清洗3次，15 min/次，加入二抗室溫孵育1 h；TBST緩沖液清洗3次，15 min/次，用辣根過氧化物酶標記的顯色劑顯色；用凝膠成像系統(tǒng)分析目的條帶灰度值[12-13]。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。各組細胞增殖抑制率、細胞上清液中TGF-β1含量、細胞中TGF-β1和CTGF表達水平以均數(shù)±標準差（x± s）表示，組間比較采用單因素ANOVA方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q法檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組結(jié)腸成纖維細胞增殖抑制率比較 見表1。

表1 各組結(jié)腸成纖維細胞增殖抑制率比較（x± s ，n = 7） %

2.2 各組結(jié)腸成纖維細胞培養(yǎng)基上清液中TGF-β1含量比較 見表 2。

表2 各組結(jié)腸成纖維細胞培養(yǎng)基上清液中TGF-β1含量比較（x± s ，n = 7） ng/mL

2.3 各組結(jié)腸成纖維細胞中TGF-β1和CTGF表達水平 灰度值分析結(jié)果顯示，黃芩苷干預(yù)結(jié)腸成纖維細胞48 h后細胞中TGF-β1蛋白表達水平明顯下降，黃芩苷高濃度組與陽性藥組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；黃芩苷中濃度組、低濃度組與陽性藥組對比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。加藥干預(yù)48 h后各組結(jié)腸成纖維細胞中CTGF蛋白表達水平均有下降，黃芩苷3個濃度組、陽性藥組與空白組對比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。黃芩苷高濃度組與陽性藥組對比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；黃芩苷中濃度組和低濃度組與陽性藥組對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1（插頁一）。

3 討論

本研究采用MTT法檢測黃芩苷對大鼠結(jié)腸成纖維細胞的增殖抑制作用，結(jié)果顯示，黃芩苷抑制細胞增殖作用明顯，且呈濃度依賴性。ELISA檢測結(jié)果表明，黃芩苷可抑制結(jié)腸成纖維細胞胞外分泌TGF-β1，同時Western blotting結(jié)果也顯示，黃芩苷能明顯抑制結(jié)腸成纖維細胞中TGF-β1和CTGF的表達。

TGF-β是一類具有多種生物學(xué)活性、多重調(diào)控功能的細胞因子，其在體內(nèi)分布廣泛，作用明顯。TGF-β不僅能調(diào)控細胞增殖，還參與細胞癌變、組織器官纖維化等病理過程。TGF-β家族有40多個成員，其中TGF-β1對纖維化具有很強的調(diào)節(jié)作用。TGF-β1是調(diào)節(jié)ECM聚集的核心因子，可刺激ECM的合成，降低ECM的降解能力[14]。研究[15]表明，TGF-β1及其受體在克羅恩病患者病變組織和腸道成纖維細胞中表達水平要高于正常腸組織。腸肌成纖維細胞根據(jù)環(huán)境變化和自身特性表達TGF-β不同亞型，當(dāng)肌成纖維細胞處于炎癥組織中，可表達TGF-β1和TGF-β3 2種亞型；當(dāng)肌成纖維細胞處于纖維組織中則減少TGF-β3表達，增加 TGF-β1和 TGF-β2的表達量。TGF-β1可刺激腸道狹窄處成纖維細胞等間質(zhì)細胞過度增殖、加強間質(zhì)細胞收縮力、增強合成膠原蛋白的能力，誘導(dǎo)其表型發(fā)生變異。同時，腸道黏膜中TGF-β1可直接刺激黏膜層、黏膜下層及黏膜固有層的間質(zhì)細胞，增加Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ等多種膠原蛋白及纖維黏連蛋白的表達。研究[16]顯示，活化的TGF-β1腺病毒基因及TGF-β1基因轉(zhuǎn)移至小鼠結(jié)腸，均可使TGF-β過表達，形成腸纖維化。

CTGF主要集中于腸道黏膜組織成纖維細胞中和腸道損傷組織區(qū)域內(nèi)，由成纖維細胞、平滑肌細胞等間質(zhì)細胞分泌合成[17]。在腸纖維化中，TGF-β主要通過Smads信號通路誘導(dǎo)多種細胞表達CTGF，同時CTGF蛋白又作用于這些細胞發(fā)揮TGF-β的促纖維化作用。因此，CTGF作為TGF-β的下游因子，兩者相互作用對腸纖維化有重要影響[18]。

本研究結(jié)果顯示，黃芩苷能抑制大鼠結(jié)腸成纖維細胞的增殖，抑制細胞分泌TGF-β1，同時下調(diào)細胞中TGF-β1和CTGF的表達，表明黃芩苷可能是通過下調(diào)細胞中TGF-β1和CTGF的表達來抑制結(jié)腸成纖維細胞的增殖，從而產(chǎn)生治療腸纖維化的作用。