梅花鹿茸I型膠原對骨質疏松大鼠Wnt/β-catenin信號通路的影響

石曉征，李 娜，李曉華，曲曉波

（長春中醫藥大學，長春 130117）

鹿茸是一種極其珍稀名貴的動物藥，具有“生精補髓，養血益陽，強筋健骨”之功效[1]。鹿茸中含有包括蛋白質在內的豐富的生物活性物質，其中以膠原蛋白含量最為豐富[2]。膠原蛋白是一種可以構成骨組織的結構蛋白，包括許多種類。 其中I型膠原廣泛分布于皮膚、肌腱、骨骼等組織，可維持骨密度，常用于骨代謝性疾病及骨質疏松癥的治療[3]。鹿茸中含有豐富的I型膠原，是其強筋健骨的根本所在。骨質疏松癥是一種全身代謝性骨病，臨床上在老年人及絕經婦女群體中較為多見[4]。由于外界環境或自身原因導致的骨質量減少和成骨不足，會進一步引起骨微結構破壞和骨脆性的增加，形成骨質疏松。隨著我國老齡化現象日趨嚴重，骨質疏松的發病率也隨之大幅提高，嚴重影響人們的生活質量[5-6]。研究[7]發現，經典的Wnt/β-Catenin 信號通路因參與成骨細胞的增殖、分化過程，并影響其活性和功能，逐漸成為科研人員對防治骨質疏松癥藥物研究的熱門方向。本課題組在此前的研究[8-12]中發現，梅花鹿茸膠原酶解物對其骨質疏松大鼠具有一定的防治作用，并成功從梅花鹿茸膠原酶解物中分離純化得到梅花鹿茸I型膠原（SDC-I）。因此，本實驗在前期工作基礎上，進一步觀察SDC-I對骨質疏松大鼠的保護作用，并探索其作用機制是否與Wnt/β-Catenin 信號通路的激活相關，為SDC-I對骨質疏松的防治提供實驗數據和理論依據。

1 材料與方法

1. 1 動物 健康清潔級Sprague Dawley（SD）大鼠，雌性，50 只，體質量（200 ± 10） g，購自長春市憶斯實驗動物技術有限責任公司，合格證號 SCXK（吉）2011-0004。

1.2 藥品與試劑 SDC-I（相對分子質量 3.1×104，質量分數56.89%）制備，長春中醫藥大學分子藥理實驗室。Trizol，購自美國Invitrogen公司；DNA分子標記，cDNA第一鏈合成試劑盒，2×SYBR PCR擴增試劑盒均購自北京百泰克公司；溴化乙錠（EB），10×loading buffer購自日本Takara公司；引物合成，安徽通用生物系統有限公司。

1.3 主要儀器 分析天平，型號BT125D ，購自德國Sartorius 公司；冷凍離心機，型號5430R，雙能X線骨密度儀，型號DPx-L，購自美國LUNAR公司；PCR儀，型號Mastercycler ，購自德國 Eppondorf 公司；核酸電泳儀，型號Min-Sub ，購自美國 Bio-Rad 公司；制冰機，型號FHB100，購自上海比朗公司；超微量紫外分光光度計，型號Colibei ，購自德國伯赫公司。

1.4 模型建立及分組給藥 將50只SD雌性大鼠，隨機分為5組：即空白組，模型組，SDC-I低、中、高劑量組。進行7 d適應性飼養，除空白組外，其余各組均進行雙側卵巢摘除手術，建立大鼠骨質疏松模型。空白組和模型組灌胃給藥等量生理鹽水，SDC-I低、中、高劑量組分別給予0.05、 0.1、0.2 g/kg SDC-I灌胃治療，每周給藥 6 d（每周日停藥），連續給藥90 d。

1.5 取材方法 給藥90 d后，將大鼠禁食1 d。經腹主動脈取血，將血清進行分離后，放入 - 80 ℃冰箱中保存備用。取大鼠右后肢股骨，將其與肌肉等其他組織剝去并碎化后，放入事先準備好的無菌 EP管中，于- 80 ℃保存，備用。

1.6 檢測指標

1.6.1 骨密度（BMD）測定 給藥前應用X 線骨密度儀檢測各組大鼠股骨的 BMD，停止給藥后再次檢測各組大鼠 BMD，觀察給藥前后大鼠 BMD變化情況[13]。

1.6.2 最大載荷測定 取各組大鼠左后肢股骨，剔除股骨上的肌肉及其他組織，稱重。將取好的各組大鼠股骨置于生物力學測定儀基座上固定。啟動儀器，當測定儀前端自動擠壓股骨斷裂時，記錄數值[14]。

1.6.3 血清生化指標測定 應用 ELISA 方法測定各組大鼠血清骨鈣素（BGP）和抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP）水平，具體操作步驟均嚴格按照各個試劑盒的說明書完成，應用酶標儀進行檢測。

1.6.4 RT-PCR測定 將保存的各組大鼠股骨從- 80 ℃冰箱中取出，立即浸入液氮中，在液氮保護下，迅速研磨至細粉。應用Trizol法提取各組大鼠骨組織中的總RNA，并利用瓊脂糖電泳檢測。取適量RNA按照試劑盒說明進行反轉錄實驗，其余樣品加入1 mL無水乙醇，- 80 ℃保存備用。設置程序：1）45 ℃，50 min；2）70 ℃，10 min。反應結束后，應用超微量紫外分光光度計檢測反轉錄液中cDNA的濃度。設置RT-PCR反應程序： 95 ℃，起始模板預變性。1）95 ℃，20 s；2）65 ℃，10 s； 3）72 ℃ ，30 s，循環40次，終止反應。以β-actin為內參基因，分析各組樣品β-Catenin、LRP5 mRNA的相對表達量，進行差異比較。引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物堿基序列

1.7 統計學方法 采用SPSS 13.0 軟件處理數據，并進行Student’s t檢驗分析，數據以均數±標準差（x± s ）表示，以 P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 SDC-I對大鼠體質量、BMD及最大載荷量的影響 見表2。

2.2 SDC-I對大鼠血清生化指標的影響 見表3。

2.3 各組大鼠股骨 β-Catenin、LRP5 mRNA 相對表達量比較 見表4。

表2 SDC-I對大鼠體質量、BMD及最大載荷量的影響（x± s ，n = 10）

表3 SDC-I對大鼠血清生化指標的影響（x± s ，n = 10） ng/mL

表4 各組大鼠股骨 β-Catenin、LRP5 mRNA 相對表達量比較（x± s ，n = 10）

3 討論

研究[15]表明，Wnt/β-Catenin信號通路的失控和失衡與骨質疏松的發生關系密切。此信號通路可通過更新干細胞、誘導分化、使成骨細胞發生、抑制各類骨組織細胞凋亡等多種方式增加骨量及骨密度[16]。其中，β-Catenin是此信號途徑中的最為關鍵的調控因子，穩定的β-Catenin聚集在細胞質內，當其轉移至細胞核內，并與轉錄因子結合后，方可啟動編碼成骨細胞的特異性轉錄因子Runx2的轉錄，達到調控骨組織細胞分化、發生、促成骨形成的目的。β-Catenin需要通過Wnt與LRP5/6在胞外結合，激發胞內信號轉導，從而使GSK-3β磷酸化失活，來維持自身的穩定[17-18]。LRP5作為Wnt信號轉導的跨膜受體，不但可以穩定β-Catenin，還可以保護成骨細胞的增殖、功能和存活不受影響，也是骨量形成過程中不可缺失的一環[19]。因此，Wnt/β-Catenin途徑是調控成骨細胞和骨形成不可或缺的重要信號轉導通路。 當此通路信號傳導失控時，將導致包括骨質疏松在內的多種骨骼性疾病的發生[20-21]。

本研究發現，大鼠雙側卵巢切除后，隨著大鼠BMD的降低，β-Catenin 和LRP5 mRNA 的表達顯著下降；而高劑量的SDC-I能在提高大鼠BMD 、最大載荷量及血清中的BGP水平的同時，有效上調β-Catenin和LRP5 mRNA 的表達。因此，SDC-I防治骨質疏松大鼠的機制可能是通過促進細胞內 β-Catenin 的穩定、集聚、轉入到細胞核中，來激活 Wnt/β-Catenin 信號轉導途徑，促進成骨分化，從而發揮抗骨質疏松作用。后續實驗將從去勢大鼠骨質疏松模型中分離培養原代成骨細胞，結合基因敲除、miRNA等技術，深入探索SDC-I到底如何通過調控Wnt/β-Catenin信號通路發揮對骨質疏松防治作用，進一步闡明 SDC-I對骨質疏松防治作用的物質基礎及分子機制。