鹿茸I型膠原對MC3T3-E1細胞TGF-β1/Smad基因蛋白表達的影響

闞 默，石曉征，曲曉波

（長春中醫藥大學，長春 130117）

骨質疏松癥是一種全身代謝性骨病，與骨質量下 降、成骨不足等原因有著密切的關聯[1-3]。現代研究發現，TGF-β/Smad信號通路參與了成骨細胞的增殖、分化過程，影響了成骨細胞活性與功能，成為了現代治療骨質疏松藥物的研究熱點[4]。在此信號通路轉導的過程中，激活了轉化生長因子-β（TGF-β）識別，活化了 Smad 2、 Smad 3蛋白[5-6]。Smad 2、Smad 3活化后與Smad 4形成異位復合物并進入細胞核內，開啟了細胞內的信號反應級聯傳導，調節靶基因的轉錄，影響了成骨細胞增殖和分化，以及 I 型膠原蛋白的合成[7-8]。

鹿茸是我國珍稀名貴的動物藥材，有“益精髓，強筋骨”之功效，并富含大量有助維持骨密度的膠原蛋白[9-11]。本課題組在此前的研究中成功從梅花鹿茸中提取了鹿茸I型膠原（SDC-I），同時發現了SDC-I可誘導骨髓基質干細胞成骨的分化[12-14]。MC3T3-E1 細胞是C57BL6 乳鼠源性的成骨細胞，常用于骨細胞的機理研究[15]。本實驗在前期工作基礎上，從MC3T3-E1細胞增殖和MC3T3-E1 細胞分泌的活性因子 TGF-β1、Smad2、Smad3 角度，對鹿茸I型膠原的作用機理進行了深度研究，旨為鹿茸I型膠原抗骨質疏松癥的治療提供理論依據。

1 材料

1.1 試劑與藥品 成骨細胞株MC3T3-E1購自于中科院上海細胞庫；SDC-I（相對分子質量 3.1 × 104，質量分數56.89%）由長春中醫藥大學分子藥理實驗室制備；Trizol（美國Invitrogen公司）；H-DMEM 培養基（美國 Gibco 公司）；胎牛血清（杭州天杭生物科技有限公司）；胰蛋白酶、乙二胺四乙酸（美國Sigma 公司）；青霉素、鏈霉素粉劑（華北制藥股份有限公司）；DNA Maker，Bio Teke super RT Kit，2×SYBR Real-time PCR premixture Kit（北京百泰克公司）；溴化乙錠（EB），10×loading buffer（日本Takara公司）；焦碳酸二乙酯（DEPC，北京鼎國公司）；引物由安徽通用生物系統有限公司合成；細胞裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、TGF-β1、Smad2、Smad3 ELISA試劑盒（美國RND公司）。

1.2 儀器 CO2細胞培養箱（日本 SHELLAB）；生物潔凈安全柜（蘇凈設備公司）； BT125D 型分析天平（德國 Sartorius 公司）；5430R型冷凍離心機、倒置 顯 微 鏡 （日 本 OLYMPUS CK40）；Mastercycler 型PCR儀（德國 Eppondorf 公司）；Min-Sub 型核酸電泳儀（美國 Bio-Rad 公司）；FHB100 型制冰機（上海比朗公司）；Omega Lum C 型凝膠成像儀（美國 Aplegen公司）；多功能酶標儀（奧地利TECAN公司）。

2 方法

2.1 MC3T3-E1細胞培養 將 MC3T3-E1細胞放置于含有10%胎牛血清DMEM培養基中，青鏈素、鏈霉素各100 u/mL，于37 ℃、5% CO2細胞培養箱內常規培養，待細胞長至80%時進行實驗。

2.2 分組及給藥 實驗分4組：空白對照組，只加培養液；SDC-I低劑量組（SDC-I-L），I 型膠原蛋白 0.2 mg/mL；SDC-I中劑量組（SDC-I-M），I 型膠原蛋白 0.4 mg/mL；SDC-I高劑量組（SDC-I-H），I 型膠原蛋白 0.6 mg/mL。

2.3 MC3T3-E1細胞活力測定 取傳代3次，處于對數生長期的MC3T3-E1單細胞懸液，調整至細胞濃度為 5×104個 /mL，接種到96孔板中，100 μL/孔 ，每組設6個復孔，培養箱中孵育貼壁。分別加入不同濃度的SDC-I，繼續培養24、48、72 h。每孔加MTT（5 mg/mL）10 μL后再次孵育4 h，棄去培養液，再加入DMSO溶液，150 μL/孔，振蕩混勻10 min，讓結晶溶解，通過多功能酶標儀在490 nm波長下檢測各孔吸光度，最后確定最佳給藥時間 。

2.4 TGF-β1/Smad信號通路相關基因表達的檢測 應用RT-PCR方法檢測TGF-β1 、Smad2、Smad3基因的表達水平。取傳代3次，處于對數生長期的MC3T3-E1細胞，用0.25%胰酶消化，將濃度為2×104個/mL細胞接種在24孔板中，待細胞貼壁后，進行分組給藥，再連續培養48 h后進行實驗。收集細胞，采用Trizol一步法提取 RNA。瓊脂糖電泳檢測總RNA，取適量RNA進行反轉錄實驗，其余加入無水乙醇1 mL混勻，置于- 80 ℃保存。按照 Bio Teke super RT Kit 說明書配制反轉錄反應液。設置程序：1）45 ℃，50 min；2）70 ℃，10 min。反應結束后冰浴，4 ℃ 保存備用。待反應結束后，通過超微量紫外分光光度計檢測反轉錄液中cDNA的濃度。按照2×SYBR RT-PCR premixture Kit 說明書配制反轉錄反應液。采用“三步法”進行RT-PCR 實驗，設置反應程序： 95 ℃，起始模板預變性。1）95 ℃，20 s；2）65 ℃，10 s；3） 72 ℃ ，30 s，循環次數為 40。記錄各組目的基因的融解曲線和擴增曲線。內參基因為β-actin，記錄并分析各組目的基因的相對表達量，進行差異性比較。引物序列，見表1。2.5 TGF-β1/Smad信號通路中相關蛋白含量檢測 用10 cm培養皿培養細胞（1×106個細胞），按照上述方法給藥后，用1 mL的0.01 mol/L PBS洗3次；加入300 μL的RAPI蛋白裂解液，冰上裂解30 min；將裂解液轉移到1.5 mL EP管中，12 000 r/min 4 ℃離心30 min，取上清。按BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書進行蛋白濃度的測定。將各組細胞總蛋白放- 80 ℃冰箱保存。利用ELISA法檢測TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白的表達，將各組成骨細胞總蛋白分別按TGF-β1、Smad2、Smad3酶聯免疫試劑盒操作說明進行檢測實驗，通過多功能酶標儀測定各孔OD值。

表1 RT-PCR引物堿基序列

2.6 統計學方法 采用SPSS 13.0 軟件進行數據處理，進行Student’s t檢驗分析，數據以均數±標準差（x± s ）表示，以 P＜0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 SDC-I對MC3T3-E1細胞增殖率影響 各組細胞給予不同濃度的SDC-I，通過MTT法檢測各組細胞的生長、增殖情況，見圖1（插頁二）。與空白對照組比較，SDC-I-L組、SDC-I-M組、SDC-I-H組均可以促進MC3T3-E1細胞增殖，同時在48 h細胞增殖作用最為明顯（P＜0.05），所以選用SDC-I作用48 h后再進行實驗。

3.2 各組MC3T3-E1細胞TGF-β1 mRNA、Smad2 mRNA、Smad3 mRNA 表達比較 見表 2。

3.3 各組MC3T3-E1細胞TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白含量比較 見表 3。

表2 各組 ME3T3-E1 細胞 TGF-β1 mRNA、Smad2 mRNA、Smad3 mRNA 表達比較（x± s ）

表3 各組ME3T3-E1細胞TGF-β1、Smad2、Smad3 蛋白含量比較（x± s ）

4 小結

鹿茸作為一種名貴中藥，具有壯腎陽、益精血、強筋骨、調沖任的功效，含有大量與骨形成相關的I 型膠原蛋白[16-17]。前期研究發現，SDC-I能促進骨髓基質干細胞向成骨細胞的分化。本研究發現， 經SDC-I干預后的成骨細胞中，TGF-β1基因以及其相關Smad2/3基因表達水平明顯受到促進，當TGF-β1蛋白表達升高時，成骨細胞中的Smad2/3蛋白表達水平也明顯提升，這表明了通過上調TGF-β1、Smad2以及Smad3基因蛋白的表達，可以促進成骨細胞中靶基因的表達，從而提高成骨細胞的分化，達到治療骨質疏松癥的目的。為進一步驗證SDC-I治療骨質疏松癥等代謝性骨疾病提供了新的有力依據。