龍膽中當藥苷和獐牙菜苦苷的含量測定及指紋圖譜研究

孫紫薇，翁麗麗，張 楠，陳 麗，侯曉琳

（長春中醫藥大學，長春 130117）

龍膽為條葉龍膽（Gentiana ma shurica Kitag.）、龍膽（Geniana scabra Bge.）、三花龍膽（Geniiarurtriflora Pall.）和滇龍膽（Gentiana rigescens Franch.）的干燥根和根莖。前3種習稱“龍膽”，后1種習稱“堅龍膽”[1]。條葉龍膽主要分布于黑龍江、遼寧、吉林、山西、陜西、

山東等??；龍膽、三花龍膽主要分布于黑龍江、遼寧、吉林、內蒙古等??；堅龍膽主要分布于四川、云南、貴州等省。龍膽最早記載于《神農本草經》，列為中品，梁代陶弘景《名醫別錄》也都有記載，在臨床上，應用的制劑主要有龍膽瀉肝丸（湯、顆粒）、龍膽散和龍澤熊膽膠囊等制劑[2]。龍膽中主要藥效成分為環烯醚萜苷類[3-5]，具有抗炎鎮痛[6-7]，健胃[8]，抗病毒[9]，抗腫瘤[10]，促進傷口愈合[11]等作用。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津高效液相色譜儀Prominence-ILC-2030（島津企業管理中國有限公司）；JA2603B電子天平（d = 0.000 1g）（上海天美天平儀器有限公司）；FA1004B電子天平（d = 0.000 01 g）（上海佑科儀器儀表有限公司）；KQ3200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DHG-9053A型電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；Water Purifier 實驗室專用超純水機；指紋圖譜軟件、統計軟件SPSS。

1.2 試藥

1.2.1 對照品 當藥苷（規格：20 mg，購于中國食品藥品檢定研究院）；獐牙菜苦苷（規格：20 mg，購于中國食品藥品檢定研究院）。

1.2.2 試劑 甲醇分析純（北京化工廠）；色譜甲醇（SK chemicals）；色譜乙腈（Fisher chemicals）；水為超純水。

1.3 藥材 以下材料收集后，置于陰涼處陰干，粉碎過篩，備用，所有采集藥材經長春中醫藥大學藥學院翁麗麗教授鑒定，均為龍膽（Geniana scabra Bge.）。見表1。

表1 龍膽不同來源材料

2 方法與結果

2.1 當藥苷與獐牙菜苦苷含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備 取當藥苷、獐牙菜苦苷對照品適量，精密稱定，加甲醇均制成每1 mL含0.025 mg的溶液，搖勻即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 取龍膽粉末約0.2 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，加入甲醇4 mL，超聲提取10 min，放冷后過濾，濾渣加入甲醇4 mL，再次超聲提取10 min，放冷后，濾過。合并續濾液，濾液置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻即得。

2.1.3 色譜條件及色譜峰歸屬 色譜柱：Agilent Innoval C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（20：80），流速：1.0 mL/min；檢測波長：240 nm；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL。 見圖1（插頁二）。

2.2 方法學考察

2.2.1 線性關系考察 取當藥苷及獐牙菜苦苷對照品溶液，依次進樣4、6、8、10、12、14 μL，按2.1.3項下測定相應峰面積，以對照品含量為橫坐標（X），相應峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線。見表2。

表2 回歸方程、線性范圍

2.2.2 精密度試驗 分別吸取2.1.1項下當藥苷及獐牙菜苦苷對照品溶液，按2.1.3色譜條件連續進樣6次，每次進樣10 μL，記錄峰面積。當藥苷RSD = 0.16%，獐牙菜苦苷RSD = 0.55%，結果表明，儀器具有良好的精密度。

2.2.3 穩定性試驗 取同一龍膽供試品溶液，室溫下放置0、2、4、6、12、24 h依法進行測定，記錄峰面積。當藥苷RSD = 0.37%，獐牙菜苦苷RSD = 0.48%。表明供試品溶液中的當藥苷及獐牙菜苦苷在24 h內穩定。

2.2.4 重現性試驗 取龍膽粉末按2.1.2項下方法制備供試品溶液6份，依次進樣，記錄峰面積，結果當藥苷RSD = 0.87%，獐牙菜苦苷RSD = 1.30%。表明方法重現性良好。

2.2.5 加樣回收率試驗 取已知龍膽樣品6份，精密稱定，加入適量的當藥苷、獐牙菜苦苷對照品溶液，按2.1.2項下方法制備，測定當藥苷、獐牙菜苦苷的含量，計算回收率，結果當藥苷平均回收率為96.63%，RSD值為1.21%；獐牙菜苦苷回收率為97.40%，RSD值為1.31%。見表3，表4。

2.3 樣品含量測定 分別取不同地區、不同部位的龍膽藥材粉末，按上述供試品溶液的制備方法和色譜條件測定當藥苷、獐牙菜苦苷的含量，結果見表5。

2.4 指紋圖譜

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Innoval C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.1%甲酸水（A）-乙腈（C），（0～11 min，2% C→5% C；11～30 min，5% C → 20% C；30～ 65 min ，20% C → 80% C；65～65.01 min，80% C→2% C；65.01～80 min， 2% C）梯度洗脫。流速：0.8 mL/min；檢測波長：240 nm；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL。

表3 當藥苷的加樣回收率（n = 6）

表4 獐牙菜苦苷的加樣回收率（n = 6）

表5 龍膽中當藥苷及獐牙菜苦苷含量測定結果

2.4.2 供試品溶液制備 同2.1.2項下供試品溶液制備。

2.4.3 不同產地龍膽根部及莖葉藥材指紋圖譜的建立 使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2004A版）對不同產地龍膽根的指紋圖譜進行分析，得到每個產地的對照譜圖，見圖2（插頁二）。

2.4.4 相似度分析 使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》對8批不同產地龍膽根對照圖譜數據進行分析，以R為參考譜圖計算相似度，計算每個產地8批樣品間的相似度，不同產地龍膽根部指紋圖譜，其相似度值均大于0.85，以每個產地的對照譜圖作為該產地龍膽藥材根部的特征指紋圖譜。不同產地龍膽藥材根部指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度在0.855～0.976之間，相似度較好，其中吉林省白山市靖宇縣與對照圖譜間的相似度最低，為0.855，其余7個產地均在0.880以上，表明吉林省白山市靖宇縣較吉林省其他7個地區具有一定特殊性。另外，8個產地之間相似度均在0.681～0.986之間波動，表明吉林省內不同產地的龍膽藥材根部的HPLC指紋圖譜具有一定差異。這可能與藥材的產地及年份有關。結果見表6。

2.4.5 系統聚類分析 指紋圖譜反映了藥材中大部分成分的信息，不同產地龍膽藥材根部指紋圖譜共有峰的峰面積，見表7。將其共有峰總面積通過SPSS 21.0統計軟件進行聚類分析，結果見圖3（插頁二）。

3 小結

3.1 色譜條件分離 本文通過查閱相關文獻[12-18]，以乙腈-水-醋酸（10：105：1）為流動相，當藥苷及獐牙菜苦苷成分未完全分離，出現峰拖尾現象，且壓力線不穩定，經反復測定，發現與酸度有關。后改變流動相，以甲醇-水（20：80）為色譜條件，當藥苷及獐牙菜苦苷完全分離。

3.2 不同產地龍膽根及根莖中當藥苷及獐牙菜苦苷含量與生態環境的相關性 不同產地龍膽根及根莖中當藥苷及獐牙菜苦苷含量的高低與其生態環境有一定的關系，獐牙菜苦苷、當藥苷在莖葉中含量較低，遠低于根及根莖中的含量；莖葉中幾乎未檢測到當藥苷的含量；花中未檢測到當藥苷、獐牙菜苦苷的含量。

表6 8批樣品根部指紋圖譜的相似度

表7 不同產地樣品指紋圖譜的共有峰面積

3.3 指紋圖譜與聚類分析 指紋圖譜與聚類分析是現代分析統計常用的手段之一，能夠較充分的提取物質獨特的信息。二者的結合為龍膽的產地識別及質量評價提供了新的思路和模式[19-20]。

不同產地的龍膽HPLC指紋圖譜與對照圖譜間的相似度均在0.855以上，說明該指紋圖譜可以代表吉林省內各產地龍膽藥材的鑒別特征。

從圖3可知，吉林省不同產地龍膽藥材所含各種有效成分分類基本相同，但含量上有一定差別，8個產地中七星百草園指紋圖譜共有峰總面積最高，吉林市江密峰鎮次之。聚類分析結果顯示，隨著閾值的增大，8個產地樣品大致可以分為兩大類，七星百草園、吉林市江密峰鎮、長春市九臺區、吉林市龍潭區楊木鄉與吉林市昌邑區左家鎮為一類，吉林省永吉縣、吉林省蛟河天崗鎮與吉林省白山市靖宇縣為一類。前5個產地又可分為兩類，其中七星百草園單獨為一類，吉林市江密峰鎮、長春市九臺區、吉林市龍潭區楊木鄉與吉林市昌邑區左家鎮為一類；后3個產地也可分為兩類，吉林省永吉縣單獨一類，吉林省蛟河天崗鎮與吉林省白山市靖宇縣為一類。