綿羊白細胞內的慢病毒cDNA gag基因的PCR檢測

阿依努爾·亞森

摘要：在對綿羊白細胞中的慢病毒Cdna gag基因進行檢驗時，通過PCG檢測技術的應用還能夠起到良好的檢測效果，對于該病毒的防治以及促進我國養殖業的發展也有著一定的積極意義。

關鍵詞：綿羊白細胞;慢病毒;PCR

中圖分類號：S585.26

文獻標識碼：B

doi： 10.3969/j.issn.2096-3637.2018.10.003

0 引言

綿羊慢病毒會直接侵害中樞神經系統，導致腦膜腦炎等疾病的發生，并有著消瘦、呼吸困難以及淋巴濾泡性間質性肺炎等臨床癥狀。其不同株盡管存在有一定的變異性，但是依舊存在有較高的同源性。通過PCR技術的應用能夠對綿羊外周血白細胞基因組中的OPP前病毒cDNAgag基因片段進行擴增整合，借此來獲得良好的OPPV檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與血液樣品

本次研究中主要選用了3株新疆拉庫爾羊陽性血液以及2株新疆拉庫爾羊陰性血液作為血液樣品。

1.1.2 試劑

主要試劑包含有OPPV抗原以及標準OPPV陽性對照血清等。此外還需要應用到Shol限制性內切酶、Tap DNA聚合酶等。

1.2 方法

1.2.1 血清學實驗

對200g凝血塊離心10 min來進行血清的分離，在-20℃低溫下進行存儲，對5株新疆拉庫爾羊的OPPV抗體進行血清檢測。

1.2.2 DNA制備

在目標樣品靜脈抽取10 mL血，加入10 U/mL的肝素以及20 mL的淋巴細胞分離液之后，利用5000 r離心速度處理5 min。移除樣品中的紅細胞跟上清液，然后加入SDS使其濃度達到0.5%，在此基礎上放入蛋白酶K進行10 h的孵育處理，期間震蕩處理2～3次。處理完成之后加入等體積的酚進行混勻處理，然后在12000 r下離心處理10 min，通過70%乙醇洗滌1～2次，在室溫條件下晾干。進行沉淀處理得到RNA酶，在4℃下進行懸浮沉淀處理5h，將制備完成后的DNA酶樣品放置在-20℃低溫下進行保存備用[l]。

1.2.3 進行白細胞疑似整合基因組的酶切

通過DNAman軟件來對OPPV基因組進行分析處理，通過Xhol以及Ndel限制內切酶進行基因組的酶切處理，在結合了基因組酶切結果基礎上進行引物的合理設置。

1.2.4

PCR產物的克隆

運用CaCl'完成DH5 α感受態細胞的制備處理工作，在pBS-T載體連接擴增片段回收產物，并進行DH5 α感受態細胞的轉化處理。然后在100 mg/mL Apm的LB固體培養基上對培養后的克隆菌株進行篩選處理。

1.2.5 鑒定

首先選取3μL擴增產物，將其放置在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳跟擴增處理。在對質粒酶切進行鑒定時，先將篩選后的陽性菌培養一夜，然后通過離心株型質粒小提試劑對質粒進行提取。通過擴增產物在1%瓊脂糖凝膠上電泳，觀察并照相。

2 結果

在經過診斷檢測之后，GAG基因PCR、菌落PCR以及重組子酶切鑒定結果分別見圖1、圖2、圖3。

3 討論

OPPV是反轉錄病毒基因組的轉錄，特點為DNA中間型，因此病毒RNA也就能夠通過pol基因編碼中的反轉錄酶轉錄為前病毒cDNA，前病毒DNA也可以直接整合在宿主的白細胞熱色提上面，并能夠在RNA多聚酶的催化作用下直接轉錄為正鏈RNA，也就是由整合在白細胞內的前病毒產生新的病毒粒子。在這一病毒表現模式之中，能夠讓病毒處于隱蔽的循環狀態中，從而躲過機體的防御系統。但是在該病毒表現機制中還給予病毒的研究工作帶來了一定的便利性，研究者們不需要再進行病毒RNA的體外反轉錄工作，僅僅憑借PCR檢測法就能夠對OPPV中前病毒cDNA起到良好的檢測效果，從而驗證病毒的存在。Gag基因作為OPPV病毒中比較保守的基因序列.慢病毒中不同株間的gag基因核苷酸序列還保持有非常高的相似性，通過Genbank中所提供的慢病毒基因序列合成物，還能夠對OPPV整合在內的白細胞中的cDNA起到良好的PCR鑒定效果，從而就該病毒的感染機制進行有效的研究。在傳統的AGID檢測以及ELISA檢測模式中，只能夠對部分感染了OPP綿羊的抗體進行檢測，但是部分病羊因為自身機體因素的影響，還存在某些時期不產生抗體或者產生的抗體過弱等問題的出現，在這些傳統的檢測模式中也就容易導致假陰性反應的發生，給羊群的凈化跟治療也就帶來的諸多的不便。通過PCR檢測法來進行前病毒cDNA的檢測過程中，其能夠使得OPPV的檢測流程變得更加的簡單跟快捷，并能夠實現OPP的早期準確檢出[2]。

在綿羊自然感染OvLV時，病毒的復制數量跟所能夠誘導的細胞數量呈正相關聯系，因此說個體素質的基因型還會對綿羊的病變情況起到直接的影響，這也就使得病程在不同階段或者不同的綿羊個體數量在整合過程中，其整合的程度跟難度也存在有非常大的差異性。為了進行模板量的合理獲取，要求研究人員在進行PCR檢測之前，通過DNAman計算機軟件進行核實的限制內切酶計算，然后在不影響研究前提下切開整個基因組。此外血液量對于研究結果也會造成比較明顯的影響，因此在實驗過程中還需要采取10 mL的血液量作為研究，并將3 mL的血液量作為對照。研究結果表明3 mL的血液量無法通過PCR擴增出特異的條帶，因此說明在PCR檢測過程中血液多少也是一項限制條素，通過10 mL血樣進行研究時還能夠促使研究結果的準確性得到大幅度的提升。在該研究中所采用的3只陽性羊中都是在發生了病毒血癥的情況下進行采血的，這種采血模式還能夠促使慢病毒前DNA的整合數量得到大幅度的提升，有利于該實驗的順利進行[3]。

在具體的操作過程之中，本次研究采用了降落PCR法來進行檢測操作，這樣一方面能夠提高產物的產量，另一方面還能夠促使PCR特異性得到大幅度的提升，從而使得目的基因得到準確的檢測。此外在本次研究中還采用了38個循環數來進行檢測，目的在于提高產物的產量。在相同條件下采用30個循環作為對照組，研究結果表明30個循環跟38個循環之間還存在有比較大的差異性，跟模板量低也有著直接的關系。當模板量比較低時，會導致PCR的初期產物量無法呈現出系數增長的情況，只能夠線性增加，而到了PCR后期之后才會呈現出系數增加的情況。

近年來我國的綿羊養殖行業得到了迅速的發展，對于我國國民經濟的增長也起到了良好的促進作用。但是在綿羊養殖過程中還容易受到病毒的影響，也就容易導致一系列疫病的發生，從而造成巨大的經濟損失。這也就要求各研究人員能夠加強對綿羊白細胞內慢病毒cDNA gag基因的檢測工作，在此基礎上進行病毒防治模式的合理選擇。該研究中發現通過PCR檢測技術能夠對綿羊白細胞內的慢病毒cDNA gag基因起到良好的檢測效果，對于促進我國綿羊養殖業的進一步發展也有著一定的積極意義。因此各研究人員需要加強對該方面的研究力度，對現有的綿羊疫病防治措施進行不斷的優化完善，幫助養殖人員獲得良好的經濟效益。

參考文獻

[1]滑留帥，王璟，陳付英，等，GDF9慢病毒載體的構建及其在山羊原代成纖維細胞中的穩定表達[J].中國畜牧獸醫，2017（9）：2566-2572.

[2]劉騰，董丹丹，張莉，等永生化綿羊肺成纖維細胞系的構建及鑒定[J].中國動物傳染病學報，2018 （2）：54-58.

[3] 黃玉，蔡蓓，王小龍，等.通過CRISPR/Cas9技術創制基因編輯山羊和綿羊模型[J]中國畜牧雜志，2017（11）：1-4.