血清4型I亞群禽腺病毒高免卵黃抗體的制備與應用

魏中鋒 杜衛賓 徐梅

摘要：本研究利用分離鑒定的FadV-4（SD株），制備FadV-4（SD株）油乳劑滅活疫苗并制備卵黃杭體，通過對該卵黃杭體的安全性和預防與治療效果進行了研究，本研究的臨床試驗結果表明卵黃杭體對FadV-4感染的預防保護率高達98.67%，對FadV-4感染的治療率高達97.33%，卵黃杭體對臨床中FadV-4的感染具有良好的預防與治療效果，可用于雞場雞安卡拉病的保健和治療。

關鍵詞：禽;腺病毒;卵黃抗體;制備;應用

中圖分類號：S851 文獻標識碼：A 文章編號：2095-9737（2018）10-0001-03

由血清4型工亞群禽腺病毒（FadV-4）引起的雞安卡拉病是近年來在我國出現的以心包積液、包涵體肝炎為主要特征的一種急性、烈性傳染病，該病傳播速度快、病死率高，給我國養禽業造成了巨大的經濟損失。由于目前尚無特效治療藥物，多數養殖單位采用抗病毒藥物來預防與治療雞安卡拉病，浪費巨大人力和物力的同時也導致預防和治療效果并不理想。卵黃抗體（IgY）又稱為卵黃免疫球蛋白，是血液中的特異性抗體在卵細胞中逐漸蓄積而形成，將卵黃中的抗體經過提取處理后即可用于相應疾病的預防和治療，且具有成本低、產量高、安全高效、性能穩定、可規模化連續生產等優點，克服了血清抗體（IgG）成本高、非特異性反應、無法連續生產等缺點，近年來在動物疫病防控中得到了廣泛應用[1]。

1 材料

1.1 毒株與疫苗

FadV-4（SD株）由本實驗室分離鑒定并保存;FadV-4（SD株）油乳劑滅活疫苗由本實驗室制備并保存。

1.2 試驗動物

無疫病感染史和禽腺病毒免疫史的健康產蛋雞30只購自菏澤市軍英養殖場;300只健康AA+自羽肉仔雞由菏澤興君種禽場提供。

1.3 主要試劑

辛酸均購自成都東金化學試劑廠;白油購自淄博嘉馳石油化工有限公司;硬脂酸鋁、司本-80、吐溫-80均購自成都東金化學試劑廠。

2 方法

2.1 產蛋雞的免疫

基礎免疫，取產蛋雞20只，于腿部肌肉多點注射FadV-4（SD株）油乳劑滅活疫苗0.2mL/只。加強免疫，于首免后21天進行二免，腿部肌肉多點注射FadV-4 （SD株）油乳劑滅活疫苗0.3mL/只。強化免疫，于二免后21天進行三免，腿部肌肉多點注射FadV-4 （SD株）油乳劑滅活疫苗0.5mL/只。維持免疫，于三免后每隔60天進行維持免疫，腿部肌肉多點注射FadV-4 （SD株）油乳劑滅活疫苗0.5mL/只。同時取10只產蛋雞作為對照組，同時于腿部肌肉多點注射同劑量的滅菌生理鹽水。

2.2 雞血清FadV-4杭體效價監測

于首次免疫后7天、14天、21天、28天、60天、120天、180天分別對所有試驗雞于翅靜脈采集血清1.0mL，常規方法分離血清。以10倍濃縮的FadV-4（SD株）滅活抗原為檢測抗原，采用瓊脂擴散方法分別測定免疫組和對照組蛋雞的血清抗體效價（1092）。

2.3 雞蛋FadV-4杭體效價監測

于首次免疫后7天、14天、21天、28天、60天、120天、180天分別采集免疫組和對照組的雞蛋，將蛋殼表面用酒精棉球擦拭清潔，打開蛋殼，取出蛋黃，加入2倍體積的滅菌生理鹽水，震蕩混合均勻后加入等體積的氯仿，震蕩混合均勻，12000 r/min離心10min后，吸取上清液即得卵黃抗體。以10倍濃縮的FadV-4（SD株）滅活抗原為檢測抗原，采用瓊脂擴散試驗方法分別測定免疫組和對照組蛋雞的卵黃抗體效價。

2.4 卵黃抗體的制備

采集瓊脂擴散試驗方法測定抗體效價在5log₂以上的雞蛋，將雞蛋浸入0.1%二氯異氰尿酸鈉水溶液中消毒15min，打破蛋殼，除去蛋清、胚盤和系帶，分離卵黃。將卵黃移至滅菌容器內，加入其7倍體積的醋酸鹽緩沖液（0.12 mol/L，pH值5.0），攪拌混合均勻，將pH值調至5.2，置2-8℃靜止過夜。次日吸取上清液，緩慢攪拌加入辛酸至終濃度為1.5%，攪拌混合均勻，置2～8℃靜止過夜。次日取上清液，將pH值調至7.2。取卵黃液經0.45μm濾膜過濾澄清，在濾液中緩慢滴人甲醛至甲醛溶液終濃度為0.05%，于室溫滅活24h，分裝后2～8℃保存。

2.5 卵黃杭體的檢驗

按照《中華人民共和國獸藥典》三部2015年版（中國獸藥典委員會編，2015）中的方法進行無菌檢驗、物理性狀檢驗、甲醛殘留量測定、辛酸殘留量測定、支原體檢驗、外源病毒檢驗、安全性檢驗、效力檢驗和抗體效價檢測等常規檢驗。同時進行雛雞預防保護試驗。

2.6 臨床應用效果研究

2.6.1 卵黃抗體對FadV-4的預防效果

將300只3日齡健康AA+自羽肉仔雞隨機分成2組（對照組和免疫組），每組150只雞，免疫組每只肉仔雞皮下注射卵黃抗體0.5mL，對照組每只肉仔雞皮下注射滅菌生注射FadV-4 （SD株）病毒液，0.1mL/只，隔離飼養，觀察至14天，統計各組雞的發病數和死亡數，分析卵黃抗體對肉仔雞人工感染FadV-4的預防效果。

2.6.2 卵黃抗體對FadV-4感染肉仔雞的治療效果

將300只3日齡健康AA+自羽肉仔雞隨機分成2組（對照組和治療組），每組150只雞，對照組和治療組雞均腿部肌肉注射FadV-4（SD株）病毒液，0.1mL/只，注射后3天，治療組每只肉仔雞皮下注射卵黃抗體0.5mL，對照組每只肉仔雞皮下注射滅菌生理鹽水0.5mL，隔離飼養，觀察至14天，統計各組雞的死亡數和治愈數，分析卵黃抗體對肉仔雞人工感染FadV-4的治療效果。

3 結果

3.1 免疫雞血清抗體效價測定結果

如圖1所示，在疫苗免疫后，免疫組蛋雞血清FadV-4抗體效價逐漸提高，至首次免疫后90天抗體效價達到峰值（8.1log2 ），隨后開始維持在一定水平，至免疫后180天，FadV-4抗體效價仍維持在7.5log2以上。

3.2 免疫雞卵黃抗體效價測定結果

如圖2所示，在疫苗免疫后，免疫組蛋雞卵黃中FadV-4抗體效價逐漸提高，至首次免疫后90天抗體效價達到峰值（7.2log2 ），隨后開始維持在一定水平，至免疫后180天，抗體消長規律與卵黃抗體消長規律基本一致，但卵黃抗體的增長趨勢較血清抗體遲3～5天，且峰值水平較血清抗體約低1個滴度，這可能是血清中抗體逐步轉移至卵黃的結果。

3.3 卵黃杭體的檢驗

3.3.1 常規檢驗結果

按照《中華人民共和國獸藥典》三部2015年版中的方法進行檢驗，卵黃抗體無菌生長;卵黃抗體為淡黃色澄明液體，久置后具有少量白色沉淀;卵黃抗體的甲醛殘留量為0.091%;卵黃抗體的辛酸殘留量<0.1%辛酸標準溶液A440;無支原體生長;無外源病毒污染;注射卵黃抗體未引起1日齡SPF雞的任何局部或全身不良反應;采用瓊脂擴散試驗方法測定卵黃抗體的抗體效價為6log2。

3.3.2 雛雞預防保護試驗結果

如表1所示，對照組雞在攻毒后，先后表現出食欲減退、精神萎靡等臨床表現，至攻毒后5天，攻毒對照組10只雞已全部死亡，剖檢死亡雞可見心包積液以及肝臟出血、腫大、變性、壞死等FadV-4感染的典型病理變化。卵黃抗體組雞在攻毒后14天內均未表現出食欲減退、精神萎靡等臨床表現，至14天，將試驗雞宰殺、解剖，內臟器官未見任何病理變化。表明卵黃抗體0.5mL的免疫劑量在免疫后5天內能完全保護FadV-4強毒株的攻擊，卵黃抗體的預防效果較好。

3.4.1 卵黃抗體對FadV-4的預防效果

如表2所示，免疫5天后，攻擊FadV-4（SD株），觀察至14天，卵黃抗體免疫組的150只肉仔雞存活148只，對照預防保護率高達98.67%。表明本研究制備的卵黃抗體能夠有效預防臨床中FadV-4的感染。

3.4.2 卵黃抗體對FadV-4感染肉仔雞的治療效果

如表3所示，人工感染FadV-4（SD株）3天后，分別注射滅菌生理鹽水和卵黃抗體作為治療藥物，觀察至14天，卵黃抗體治療組的150只肉仔雞存活146只，對照組的150只肉仔雞死亡147只，卵黃抗體對FadV-4感染的治療率高達97.33%。表明本研究制備的卵黃抗體對臨床中FadV-4的感染具有良好的治療效果。

4 討論

4.1 卵黃抗體的優越性

卵黃抗體（IgY）又稱為卵黃免疫球蛋白，是禽類血清中免疫球蛋白G（IgG）移行至卵黃中形成的多克隆抗體[2]，本研究的卵黃抗體化學性質穩定，與血清抗體相比較具有成本低、易于制備、可規模化生產、可連續性生產等優點，其通過被動免疫可使免疫動物獲得堅實的保護力，是疫病預防和治療的良好獸用生物制品，在動物疫病防控中將具有廣闊的應用前景。

4.2 瓊脂擴散試驗檢測方法的建立

瓊脂擴散試驗（AGP）是通過可溶性抗原與相應抗體在瓊脂凝膠中自由擴散，當抗原和抗體發生特異性反應后形成肉眼可見的自色沉淀線，如抗原和抗體不發生特異性反應則不會出現沉淀線，可用于抗原或抗體的定性檢測[3]。瓊脂擴散試驗為經典的抗原抗體檢測方法，雖然敏感性和特異性落后于ELISA等免疫學檢測方法，但具有試驗成本低廉，操作簡單，特別適合于基層應用等優點。本研究經過前期反應條件的不斷優化，最后表明10倍濃縮的FadV-4滅活抗原作為檢測抗原時，其檢測結果易于觀察。

4.3 卵黃杭體提取方法的選擇

卵黃的主要成分為蛋白質和脂類，其中以脂蛋白占大部分，而抗體為水溶性蛋白，卵黃抗體的提取就是將卵黃中抗體和其他成分分離，從而去除脂類成分，保留水溶性的卵黃抗體[4]。本研究選擇辛酸提取法對卵黃抗體進行了提取，后期檢驗表明提取后的卵黃抗體具有良好的抗體效價與預防治療效果，取得了理想的試驗結果。

4.4 卵黃杭體檢驗項目的選擇

由于目前國內尚無商品化的雞安卡拉病卵黃抗體，也無雞安卡拉病卵黃抗體的制造與檢驗操作規程，而卵黃抗體的檢驗是卵黃抗體安全與有效的保障，對卵黃抗體的臨床應用至關重要。本研究通過對制備的FadV-4（SD株）卵黃抗體進行無菌檢驗、物理性狀檢驗、甲醛殘留量測定、辛酸殘留量測定、支原體檢驗、外源病毒檢驗、安全性檢驗、效力檢驗等常規檢驗，且檢驗結果表明本研究制備的FadV-4（SD株）卵黃抗體能夠達到國家對禽類病毒病卵黃抗體同類產品質量的標準要求，為FadV-4（SD株）卵黃抗體的臨床推廣應用提供了質量保障。

4.5 卵黃杭體的應用效果

本研究的臨床應用試驗結果表明卵黃抗體對FadV-4感染的預防保護率高達98.67%，對FadV-4感染的治療率高達97.33%，卵黃抗體對臨床中FadV-4的感染具有良好的預防與治療效果，可用于雞場雞安卡拉病的保健和治療。為我國雞安卡拉病的預防與治療提供了一種快速、簡單、安全、有效的技術手段，將具有很好的推廣和應用前景，對于逐步降低我國雞安卡拉病的感染率、保障我國養禽業的健康與快速發展將具有十分重要的現實意義。

參考文獻：

[1]亓秀曄，宋翔，王業華，等.卵黃抗體在疾病防治中的應用[J].中國動物傳染病學報，2017，25（5）：80-86.

[2]孫麗娜，孫萬邦.卵黃抗體的結構與功能其在人及動物疾病中應用進展[J].中國人獸共患病學報，2018，34（1）：1 -10.

[3]張瑩輝，吳思捷，薛麒，等.卵黃抗體三種提取方法的比較研究[J].中國獸藥雜志，2015，49（8）：51 -54.

[4]劉坤洋.瓊脂擴散試驗的影響因素及注意事項[J].新農業，2015（9）：50.