分子育種技術(shù)在肉牛育種中的應(yīng)用研究進(jìn)展

丁麗艷 殷元虎 韓永勝 宋斌 丁得利 李同豹 孫芳

摘要：隨著分子遺傳學(xué)和現(xiàn)代生物技術(shù)的快速發(fā)展，分子數(shù)量遺傳學(xué)也得到了相應(yīng)發(fā)展，這為分子育種技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)一步應(yīng)用提供了基礎(chǔ)與保障。與傳統(tǒng)的育種方法相比，動(dòng)物分子育種是直接在分子水平上對(duì)性狀的基因進(jìn)行選擇，因此選種和育種的準(zhǔn)確性都非常更高。現(xiàn)綜述分子育種技術(shù)在肉牛育種中應(yīng)用進(jìn)展，為肉牛分子育種技術(shù)的應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞：肉牛;分子育種;墓因診斷;應(yīng)用

中圖分類號(hào)：S823.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：2095-9737（2018）10-0021 -2

自20世紀(jì)80年代以來，隨著信息技術(shù)和分子生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，動(dòng)物分子育種技術(shù)的研究取得了一系列突破性的進(jìn)展，動(dòng)物的育種技術(shù)已逐漸從宏觀的群體水平進(jìn)入微觀的分子水平，隨著動(dòng)物分子育種理論基礎(chǔ)不斷完善，應(yīng)用技術(shù)不斷成熟，各種現(xiàn)代生物技術(shù)的綜合應(yīng)用，肉牛分子育種工作取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。

1 分子育種技術(shù)在肉牛品種間親緣關(guān)系的診斷

應(yīng)用分子診斷技術(shù)能夠檢測(cè)各品種牛間的親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。Mannen et al應(yīng)用線粒體分析亞洲各國牛mtDNA控制區(qū)的序列變異頻率以了解牛的起源，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1/5蒙古牛攜帶瘤牛單倍體，而日本牛和韓國牛攜帶普通牛的單倍體。Kierstein et al應(yīng)用線粒體分析不同來源水牛品種mtDNA D-loop序列，發(fā)現(xiàn)128個(gè)多態(tài)位點(diǎn)和36個(gè)mtDNA單倍體，分析表明沼澤型水牛和河流型水牛訓(xùn)化地點(diǎn)都可能是亞洲次大陸。Tu et al用分子診斷技術(shù)分析了牦牛mtD-NA多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)牦牛與普通牛多態(tài)性區(qū)別明顯，依此估測(cè)到牦牛和普通牛祖先分化時(shí)間大約相差十萬年。

Amano et al用分子診斷技術(shù)分析了沼澤水牛與湖泊水牛及水牛與家牛之間的遺傳關(guān)系，發(fā)現(xiàn)不同生存環(huán)境下的水牛遺傳關(guān)系較近，而水牛與家牛之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。孟彥采用SSCP方法對(duì)11個(gè)中國地方黃牛個(gè)體線粒體DNAD-loop序列和12S rRNA基因的多態(tài)性研究，結(jié)果表明日本黑牛、安格斯牛和海福特牛親緣關(guān)系較近，而西門塔爾牛、蒙古牛、延邊牛親緣關(guān)系較近。

2 分子育種技術(shù)在肉牛生長發(fā)育相關(guān)性狀基因中的分子診斷

肉牛的生長發(fā)育候選基因的研究涉及肉牛的體重、體高、體長、十字部高、腰角寬和日增重等，主要包含ACAN、POUIF1、LPL、GH、IGF、DGAT2等基因。

ACAN是核心蛋白聚糖的一種，是牛矮小癥狀的主要候選基因。Cavanagh et al發(fā)現(xiàn)攜帶ACAN基因的牛在生長過程中表現(xiàn)侏儒癥。POUIF1基因在牛胚胎分化和生長發(fā)育過程中具有重要的作用，通過促進(jìn)GH、PRL和TSHβ及自身基因的轉(zhuǎn)錄，來實(shí)現(xiàn)對(duì)牛生長發(fā)育等性狀的調(diào)控，促進(jìn)相關(guān)基因細(xì)胞系的生長和發(fā)育。劉波等通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)POUIF1-E6H基因座與秦川牛的體重、體尺等生長性狀之間存在相關(guān)性，胸圍、十字部高指標(biāo)相比，AB和BB基因型個(gè)體顯著高于AA型個(gè)體，且相關(guān)基因與育肥性狀關(guān)系較大。LPL是一種脂肪分解酶，在脂蛋白中的載脂蛋白C2的輔助和催化下，LPL在脂類代謝和運(yùn)輸中發(fā)揮著重要作用。邱國宇利用秦川牛和南陽牛為研究對(duì)象，研究LPL基因多態(tài)性與牛生長發(fā)育性狀的關(guān)系，結(jié)果表明秦川牛雜合子（AB）型基因，在體重、體高、十字部高、體斜長、胸圍和尻長指標(biāo)上顯著高于純合子（AA和BB），而南陽牛雜合子（AB）個(gè)體在初生重指標(biāo)上顯著高于純合子（AA、BB）個(gè)體。

GH是由腦垂體前葉細(xì)胞分泌的一種單一肽鏈的生長激素，它能調(diào)節(jié)牛的所有組織和細(xì)胞的生理功能，控制著牛的生長激素分泌水平和生長發(fā)育。Sneyers研究發(fā)現(xiàn)在7月齡和13月齡比利時(shí)牛自花公牛群體中，基因型AA個(gè)體體重高于AB型，且GH的多態(tài)性與肉牛的瘦肉率也有一定的相關(guān)性。高雪等對(duì)GH基因研究表明GH-P3即第5外顯子2141bp處和3'的GH-P4位點(diǎn)顯著影響牛的體重、體高、體斜長、胸圍和肉用指數(shù)。IGF是一種生長激素依賴性多肽，它可以促進(jìn)蛋白同化和有絲分裂作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞增生及分化IGF有IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ兩種類型。IGF-Ⅱ調(diào)節(jié)胚胎時(shí)期的發(fā)育，IGF-Ⅰ則調(diào)節(jié)出生后的個(gè)體生長和發(fā)育。DGAT2是合成甘油三酸脂過程中的關(guān)鍵酶，在脂肪代謝、脂類在組織中的沉積、腸道脂肪的吸收中發(fā)揮重要作用。張爭(zhēng)鋒等研究南陽牛DGAT2基因第6內(nèi)含子多態(tài)性與體重、體尺性狀的關(guān)系，結(jié)果表明2歲體重、6月齡體高、6月齡到2歲的胸圍和體斜長相比，AA基因型南陽牛個(gè)體顯著地高于雜合基因型AB。

3 分子育種技術(shù)在肉牛桐體和肉質(zhì)相關(guān)性狀基因中的分子診斷

隨著生活水平的提高，人們對(duì)肉質(zhì)的要求越來越高，因此對(duì)肉質(zhì)性狀基因的研究成為肉牛育種工作中的一個(gè)重點(diǎn)。主要衡量指標(biāo)有胭體重、大理石花紋等級(jí)、眼肌面積、背膘厚度、瘦肉率、嫩度、肌肉pH值、肌肉剪切力等，主要相關(guān)基因

MSTN基因突變可使牛出現(xiàn)雙肌性狀，在同一飼養(yǎng)條件下，雙肌牛產(chǎn)肉性能是普通牛的1.3倍，且骨骼較細(xì)，肌肉發(fā)達(dá)、瘦肉率高、肉質(zhì)細(xì)嫩。McPherron et al在對(duì)比利時(shí)藍(lán)白花雙肌牛研究中發(fā)現(xiàn)，MSTN基因的11個(gè)核苷酸缺失導(dǎo)使MSTN基因所翻譯出的蛋白質(zhì)改變，失去了抑制肌肉生長的功能，表現(xiàn)出肌肉增大現(xiàn)象。而鈣激活蛋白酶（cal-pains）是痕橡基的蛋白酶，主要位于肌纖維附近和肌質(zhì)網(wǎng)膜上，在動(dòng)物屠宰后的肉成熟過程中起著著色的作用，同工酶μ-calpaind能夠分解肌肉細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，從而起到嫩化肌肉的作用。FABPS即脂肪酸結(jié)合蛋白，在脂肪酸生成過程中參與細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的運(yùn)輸，加強(qiáng)脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)擴(kuò)散，參與細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的攝取，促進(jìn)細(xì)胞膜吸附脂肪酸，調(diào)整細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的濃度。

MyoD1基因參與動(dòng)物體多種分化細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌細(xì)胞的生產(chǎn)過程，是骨骼生長和再生過程的一個(gè)轉(zhuǎn)化因子，影響著肌肉組織結(jié)構(gòu)的表達(dá)。黃萌等以秦川牛、魯西牛和西門塔爾牛為研究對(duì)象，利用PCR-RFLP法分析MyoD1基因多態(tài)性與相應(yīng)牛個(gè)體的胭體性狀關(guān)聯(lián)性，結(jié)果表明MyoD1基因C1867T位點(diǎn)對(duì)肉牛的背膘厚、大腿肉厚度的影響差異極顯著。PRKAG3是蛋白激酶（AMPK）的r3亞基構(gòu)成的三聚體，具有肌肉特異表達(dá)的特性，通過對(duì)七個(gè)品種牛的PRK-AG3基因多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)第4內(nèi)含子存在兩處突變，且不同基因型對(duì)應(yīng)的嫩度性狀差異顯著，同時(shí)也影響牛肉的pH值和色澤。

4 分子育種技術(shù)在肉牛繁殖相關(guān)性狀基因中的分子診斷

繁殖性狀是牛育種中一個(gè)重要的性狀，繁殖性能的高低直接影響?zhàn)B殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。繁殖性狀涉及牛的雙胎性能，一般自然狀態(tài)下，牛為單胎動(dòng)物，雙胎率只有0.15%左右。牛的繁殖性狀候選基因主要包括FSHR、LH、GDF9、RXRG、GnRH等。

FSHR為促卵泡素受體基因，是G蛋白耦合受體。雷雪芹等以秦川牛單、雙胎母牛為對(duì)象研究FSHR基因的多態(tài)性，結(jié)果雙胎母牛的雙胎牛和單胎牛之間FSHR基因的第10個(gè)外顯子的突變率差異顯著。魏伍川等也研究表明FSHR基因與牛的繁殖性狀存在連鎖相關(guān)。LH是促黃體素基因，與促卵泡素FSH協(xié)同促進(jìn)卵泡生長成熟，參與內(nèi)膜細(xì)胞合成雌激素，誘發(fā)動(dòng)物排卵，促進(jìn)黃體生成，LH由α和β兩個(gè)亞基因構(gòu)成。劉繼豐等發(fā)現(xiàn)LHβ不同基因型西門塔爾牛和夏洛牛的凍精畸形率和射精量顯著不同，這表明LHR基因是影響精液品質(zhì)的一個(gè)主效基因。GDF9即生長分化因子9基因，是卵母細(xì)胞分泌的生長因子，調(diào)節(jié)卵巢卵泡的生長和分化，對(duì)動(dòng)物繁殖起著重要作用。張路培等E227以魯西黃牛為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)在GDF9的3' UTR缺失突變，且雙胎牛的B等位基因頻率顯著高于單胎牛。RXRG即視黃酸X受體γ基基因，參與上皮細(xì)胞生長、細(xì)胞分化、胎兒發(fā)育等作用。RXRG基因定位于牛的3號(hào)染色體上，在肌肉中完全表達(dá)。黃萌等研究發(fā)現(xiàn)不同基因型魯西單、雙胎牛RXRG基因位于3' UTR多態(tài)位點(diǎn)差異極顯著，這表明RXRG基因與魯西牛雙胎性狀具有密切相關(guān)性。GnRH即促性腺激素釋放激素，與特異性受體（GnRHR）結(jié)合后，通過調(diào)節(jié)LH和FSH的水平來刺激性激素的產(chǎn)生、卵泡和精子的發(fā)育，從而調(diào)控卵巢和攀丸的功能，因此在繁殖中起到重要作用，外源

5 分子育種技術(shù)在肉牛毛色性狀相關(guān)基因中的分子診斷

牛的毛色是品種的重要特征，可以根據(jù)毛色來判斷個(gè)體的純系程度，且毛色與牛乳、肉的生產(chǎn)性能也有一定的關(guān)系。牛的皮膚和毛的色素是由“黑色素”物質(zhì)構(gòu)成的，黑色素的合成是調(diào)控系統(tǒng)作用的結(jié)果。目前與黑色素細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的基因主要包括MC1R、Agouti等基因。

MCIR是黑素皮質(zhì)素受體1基因，是調(diào)節(jié)真黑色素形成的關(guān)鍵受體。MCIR有α-MSH和ACTH兩種配體，α-MSH能夠促進(jìn)黑色素細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂，促進(jìn)黑素源的形成，通過黑素體的擴(kuò)散，使動(dòng)物皮膚變黑。α-MSH與ACTH結(jié)合，可引起cAMP水平的提高，激發(fā)酷氨酸酶的增加，從而導(dǎo)致真黑素的形成。Maudet et al對(duì)不同毛色的4個(gè)品種牛進(jìn)行了基因分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MCIR基因呈多態(tài)性，并測(cè)出四個(gè)基因型，ED、E+、E1、e。Shinji等用分子診斷技術(shù)分析了日本黑牛、褐色牛和朝鮮牛的MCIR基因型的頻率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)褐色牛遠(yuǎn)小于朝鮮牛的e基因型頻率，但兩種牛的毛色卻很相似，推斷牛的毛色還由其他基因決定。進(jìn)一步研究表明Agouti基因的表達(dá)與否會(huì)引起偽黑素的產(chǎn)生和真黑素的轉(zhuǎn)換表達(dá)Agouti對(duì)牛的脂肪組織具有調(diào)控作用。Michael應(yīng)用分子診斷技術(shù)對(duì)8個(gè)品種牛中提取的毛Agouti的mRNA，發(fā)現(xiàn)有3種mRNA有5'端的非翻譯區(qū)發(fā)現(xiàn)突變。

6 分子育種技術(shù)在肉牛抗病性相關(guān)基因中的診斷

在牛育種中，抗病性基因的診斷也是育種的重點(diǎn)，牛的抗病性相關(guān)基因主要是MHC-DRB基因，它是牛主要組織相容性復(fù)合物（MHC）基因家族中的Ⅱ類基因，是主要的功能基因，經(jīng)研究MHC-DRB基因編碼的MHC抗原與免疫應(yīng)答和牛的抗病有著密切的關(guān)系。王興平等利用PCR-RFLP技術(shù)在魯西牛、秦川牛、晉南牛和南陽牛群體中發(fā)現(xiàn)DRB3.2基因第2外顯子的第154位C突變?yōu)锳。包鵬甲等采用分子診斷技術(shù)對(duì)三個(gè)品種的牦牛個(gè)體的BoLA-DRB3基因進(jìn)行分析，結(jié)果三個(gè)品種的個(gè)體間DRB3基因具有高度多態(tài)性，這表明BOLA-DRB3多態(tài)性在牦牛抗病育種方面具有獨(dú)特作用。

7 結(jié)語

雖然分子育種技術(shù)在牛的品種間親緣關(guān)系的診斷，生長發(fā)育、月同體和肉質(zhì)、繁殖、毛色及抗病性狀相關(guān)基因的診斷方面取得了一定的進(jìn)展，但是分子育種技術(shù)的研究還不夠完善，許多功能基因的研究只限于局部的某一片段，還缺少該功能基因的全部基因序列的研究，且不能作為獨(dú)立的育種技術(shù)進(jìn)行應(yīng)用。但是隨著分子生物技術(shù)的不斷提高，研究的不斷深入，分子育種技術(shù)基礎(chǔ)將會(huì)越來越完善，應(yīng)用條件將日臻成熟，分子育種技術(shù)會(huì)在肉牛育種中廣泛應(yīng)用，在育種中發(fā)揮重要作用。