消痔方醇提工藝和顆粒制劑含量測定方法

李成職 劉洋 劉小紅 高華 孫世偉 侯玉雪 王威 劉坤

摘要： 為了制備臨床經(jīng)驗消痔方的口服顆粒制劑，本文以大黃素和大黃酚總量及出膏率為評價指標，建立消痔方中熟大黃和秦艽藥材的醇提工藝。采用平行試驗法對消痔方中熟大黃和秦艽藥材的提取次數(shù)進行選擇，采用正交試驗優(yōu)選乙醇體積分數(shù)、乙醇用量和提取時間，優(yōu)化出最佳醇提工藝為加6倍量70%的乙醇，回流提取3次，提取時間為3 h。顆粒制劑中大黃素和大黃酚的含量測定采用高效液相色譜法，色譜柱為Kramosil ODS（46 mm×250 mm，5 μm），流動相為甲醇-01%磷酸溶液（80∶20），流速為10 mL/min，檢測波長為254 nm，大黃素和大黃酚進樣量分別在0043 52～0217 60 μg和0089 6～0448 0 μg范圍內(nèi)，峰面積積分值與進樣量呈線性關(guān)系（r=0999 9），平均加樣回收率分別為9835%和10036%，相對標準偏差分別為207%和261%。該測定方法為消痔方口服固體醫(yī)院制劑的研發(fā)提供了理論參考。

關(guān)鍵詞： 消痔方顆粒； 提取工藝； 正交試驗； 高效液相色譜法； 大黃素； 大黃酚

中圖分類號： R284.2文獻標識碼： A

收稿日期： 20170912； 修回日期： 20171122

基金項目： 青島市民生科技計劃項目（159288nsh）

作者簡介： 李成職（1982）， 碩士研究生， 主要研究方向為天然活性物質(zhì)與創(chuàng)新藥物。

通訊作者： 劉坤（1962）， 女， 教授， 主要研究方向為天然活性物質(zhì)與創(chuàng)新藥物。Email： kunliu62@126.com消痔方來自已故名老中醫(yī)陸永昌主任醫(yī)師的臨床經(jīng)驗方，由熟大黃、秦艽、金銀花、連翹、防風、郁金等9味藥材配伍組成，諸藥合用，具有清熱解毒，行氣化瘀，消腫止痛之功能，用于治療因氣滯血瘀兼濕熱毒所致的痔瘡[1]。原方以水煎湯劑應用于臨床，但湯劑在煎煮過程中由于參數(shù)不量化造成的質(zhì)量不穩(wěn)定、服用順應性差、攜帶不方便、不易保存、需臨用新制等缺點，本文擬選用在湯劑基礎上提取顆粒劑為消痔方劑型[23]。消痔方中大黃的有效成分為蒽醌類化合物，秦艽的有效成分為環(huán)烯醚萜苷類化合物，現(xiàn)代藥理學研究結(jié)果表明，大黃所含的蒽醌類化合物具有抗炎、抗菌、抗病毒、瀉下等作用[49]，秦艽所含的環(huán)烯醚萜苷類化合物具有抗炎、止痛等作用[911]，因此，建立科學合理的提取工藝和質(zhì)量標準是醫(yī)院制劑開發(fā)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究以大黃素和大黃酚總量、出膏率為評價指標，采用平行試驗法優(yōu)化消痔方中熟大黃和秦艽藥材提取次數(shù)，正交試驗法優(yōu)化乙醇體積分數(shù)、乙醇用量和提取時間，利用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測定消痔方顆粒制劑中大黃素和大黃酚的含量。該研究為消痔方口服固體醫(yī)院制劑的研發(fā)提供參考，具有一定的實用價值。

1實驗

1.1儀器與材料

儀器：LC20AT輸液泵，SPDM20A二極管陣列檢測器，LC solution色譜工作站（日本島津制作所）；AL104分析天平（梅特勒托利多儀器有限公司）；色譜柱Kromasil ODS（46 mm×250 mm，5 μm，瑞典阿克蘇諾貝爾公司）；電子恒溫水浴鍋（上海科儀實驗儀器廠）；Dz*2BC型真空干燥箱（天津泰斯特儀器有限公司）。

材料：痔瘡方提取用藥購于安徽毫州市永剛飲片有限公司，符合中國藥典規(guī)定標準。大黃素對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號20131203）；大黃酚對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號20130320）；甲醇為色譜純（美國天地有限公司）；水為重蒸水，其他試劑均為分析純。

1.2實驗方法

1.2.1提取工藝研究

1）提取次數(shù)的選擇。稱取熟大黃30 g，秦艽20 g，加入6倍量70%的乙醇，回流提取4次，每次2 h，對提表1因素水平表

水平乙醇體積

分數(shù)A/%加醇量

B/倍提取時間

C/min15036027061203909180取液進行收集、濃縮，定容于100 mL量瓶中作為樣品溶液，最后測定大黃素和大黃酚總量和出膏率。

2）乙醇體積分數(shù)、乙醇用量和提取時間的選擇。分3個水平對影響因素乙醇體積分數(shù)、乙醇用量和提取時間進行正交試驗優(yōu)選，因素水平如表1所示。稱取熟大黃30 g、秦艽20 g各9份，分別按表1加入相應倍量不同體積分數(shù)的乙醇回流提取3次，每次提取相應時間，提取液分次濾過、合并、濃縮，分別用相應溶劑定容于100 mL量瓶中作為樣品溶液，最后測定大黃素和大黃酚總量及出膏率。

1.2.2測定方法[1215]

1.2.2.1出膏率的測定

量取樣品溶液20 mL，置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105 ℃干燥至恒重，置于干燥器中，冷卻30 min后稱重，計算出膏率。

1.2.2.2大黃素與大黃酚含量測定

1）色譜條件。色譜柱為Kramosil ODS（46 mm×250 mm，5 μm），流動相為甲醇-01%磷酸溶液（80∶20），流速為10 mL/min，檢測波長為254 nm，柱溫為室溫。

2）大黃素對照品溶液制備。精密稱取大黃素對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為544 μg/mL的溶液。

3）大黃酚對照品溶液制備。精密稱取大黃酚對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為1120 μg/mL的溶液。

4）提取樣品供試品溶液制備。精密量取提取樣品溶液10～40 mL，蒸干，向殘渣中加水20 mL和鹽酸2 mL使其溶解，加熱回流1 h，取出，立即冷卻，用乙醚120 mL分6次萃取，萃取液蒸干，殘渣用甲醇定容于100 mL量瓶中，濾過，精密量取續(xù)濾液50 mL，定容于25 mL量瓶中，即得。

5）顆粒制劑供試品溶液制備。取本品內(nèi)容物，研細，取約25 g，精密稱定，用甲醇索氏回流提取至提取液無色，蒸干，殘渣加水20 mL和鹽酸2 mL使其溶解，加熱回流1 h，取出，立即冷卻，用乙醚120 mL分6次萃取，萃取液蒸干，殘渣用甲醇定容于100 mL量瓶中，濾過，精密量取續(xù)濾液50 mL，定容于10 mL量瓶中，即得。

6）測定法。分別精密吸取大黃素和大黃酚對照品溶液及供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測定，利用外標一點法計算大黃素和大黃酚的含量。

2實驗結(jié)果與分析

2.1提取次數(shù)的選擇

采用平行實驗法對提取次數(shù)進行選擇，提取次數(shù)對提取量的影響結(jié)果如表2所示。由表2可以看出，當提取3次時，浸膏量占總浸膏量的9426%，大黃素與大黃酚之和占總大黃素與大黃酚提取量的9923%。按生藥計算，大黃素與大黃酚的轉(zhuǎn)移率為8047%，因此選擇提取次數(shù)為3次。

5157.487 09332111.509 530.092 45223117.214 5184.381 5采用SPSS 170軟件分別對出膏率、大黃素和大黃酚提取量作方差分析和極差分析，出膏量極差分析結(jié)果如表4所示，大黃素和大黃酚提取量極差分析結(jié)果如表5所示。由表4可以看出，各因素對醇提工藝出膏量影響程度大小依次為A>B>C；由表5可以看出，各因素對醇提工藝大黃素和大黃酚提取量影響程度大小依次為A>C>B。出膏量方差分析結(jié)果如表6所示，大黃素和大黃酚提取量方差分析結(jié)果如表7所示。由表6和表7可以看出，對醇提工藝有顯著性影響因素為乙醇體積分數(shù)，加醇量和提取時間對醇提工藝無顯著性影響。綜上分析，優(yōu)選出理論最佳提取工藝為A2B2C3，即6倍量70%的乙醇提取3次，每次提取時間為3 h。

2）線性關(guān)系考察。精密稱取大黃素對照品，加甲醇制成質(zhì)量濃度為1088 μg/mL的溶液，精密吸取10，20，30，40，50 mL，分別置于50 mL量瓶，加甲醇至刻度，搖勻，分別精密吸取20 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積積分值。以峰面積積分值為縱坐標，大黃素進樣量為橫坐標進行線性回歸。結(jié)果表明，大黃素進樣量在0043 52～0217 60 μg范圍內(nèi)，峰面積積分值與大黃素進樣量呈線性關(guān)系，回歸方程為Y=1 822 461X-231，相關(guān)系數(shù)r=0999 9。精密稱取大黃酚對照品，加甲醇制成質(zhì)量濃度為560 μg/mL的溶液，精密吸取20，40，60，80，100 mL，分別置于25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，分別精密吸取20 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積積分值。以峰面積積分值為縱坐標，大黃酚進樣量為橫坐標進行線性回歸。結(jié)果表明，大黃酚進樣量在0089 6～0448 0 μg范圍內(nèi)，峰面積積分值與大黃酚量呈線性關(guān)系，回歸方程為Y=2 380 069X-13 435，相關(guān)系數(shù)r=0999 9。

3）重復性實驗。精密吸取同一供試品溶液連續(xù)進樣6次，每次20 μL，測定大黃素與大黃酚峰面積積分值，相對標準偏差分別為019%和024%。

4）穩(wěn)定性實驗。取同一供試品溶液，在室溫下分別于0，2，4，6，8 h，按照122中2）的方法測定。測定結(jié)果表明，在8 h內(nèi)，供試品溶液中大黃素與大黃酚的含量基本無變化，相對標準偏差分別為023%和053%。

5）重現(xiàn)性實驗。取同一批號供試品6份，按照1222中的方法測定，測得大黃素與大黃酚的平均含量分別為0164 0 mg/g和0966 5 mg/g，相對標準偏差分別為226%和156%。

6）準確度實驗。精密稱取大黃素含量0164 0 mg/g，大黃酚含量0966 5 mg/g的供試品5份，每份125 g，置索氏提取器中，分別加入質(zhì)量濃度的0109 mg/mL的大黃素對照品溶液20 mL，質(zhì)量濃度0582 mg/mL的大黃酚對照品溶液20 mL，揮干溶劑，按1222中的方法測定，大黃素和大黃酚加樣回收率測定結(jié)果如表8和表9所示。由表8可以看出，大黃素平均加樣回收率為9835%，相對標準偏差為207%；由表9可以看出，大黃酚平均加樣回收率為10036%，相對標準偏差為261%。

結(jié)束語

目前痔瘡的治療以非手術(shù)治療為主，但市場上銷售的用于痔瘡治療藥物多為外用制劑。口服方劑痔瘡方為已故全國首批名老中醫(yī)陸永昌主任醫(yī)師治療氣滯血瘀兼濕熱毒所致混合痔的臨床經(jīng)驗方，建立科學合理的提取工藝和質(zhì)量標準是醫(yī)院制劑開發(fā)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究建立的消痔方中熟大黃和秦艽藥材的醇提工藝和顆粒制劑中大黃素和大黃酚的含量測定方法，為消痔方口服固體醫(yī)院制劑的研發(fā)提供參考。在此基礎上，下一步研究方向是開展消痔方顆粒制劑抗炎、止痛、止血等藥效學研究進而評價提取工藝的可行性。

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