Med-19基因對膀胱癌細胞遷移及侵襲能力的影響

李玉兵 江少波 任小剛 求旦旦

膀胱癌是泌尿生殖系統最常見的惡性腫瘤，約占全身惡性腫瘤的4.6%，大多數膀胱癌為移行細胞癌（transitional cell carcinoma，TCC），5年內復發率為50%～70%，并有10%～30%進展為肌層浸潤性膀胱癌，50%～80%的膀胱癌會發生轉移和侵襲，且轉移和侵襲是導致膀胱癌治療失敗的主要原因。Med-19基因在人體內已被定義為腫瘤相關基因，在胃癌、肺癌、骨肉瘤、腦星型細胞瘤等許多惡性腫瘤組織中都存在高表達，而其來源的正常組織或良性病變則低表達或不表達。目前有研究發現，在高分級、肌層浸潤性腫瘤、淋巴結轉移、復發腫瘤及腫瘤較大情況下，Med-19基因表達水平均明顯高于正常組及低級別組，提示Med-19基因的表達異?？赡軈⑴c膀胱黏膜的惡性轉化過程，然而抑制Med-19基因表達是否能夠影響膀胱癌細胞的遷移及侵襲能力尚無研究。本實驗采用人膀胱癌T24細胞株為對象，采用小RNA干擾的方法沉默Med-19基因表達，并觀察T24細胞遷移及侵襲功能的改變。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人膀胱癌細胞株T24（中國科學院上海細胞生物研究所）；胎牛血清、RPMI-1640 培養基和脂質體Lipofectanine2000TM（Invitrogen公司）；鼠抗人非特異性mIgG、Med-19兔多抗（Santa-Cruz Biotechnology公司）；Transwell chamber（8μm孔徑）購于Costar公司。

1.2 pSilencer-Med-19-siRNA載體構建 采用以往文獻報道，設計針對Med-19基因的特異siRNA（5'-GGTGAAGGAGAAGCTAAGT-3'），連接入pSilencer表達載體，酶切測序鑒定pSilence-Med-19-siRNA載體構建成功，本部分實驗由上海吉凱基因技術有限公司完成。

1.3 細胞培養及T24細胞轉染 人膀胱癌T24細胞培養于含10%胎牛血清的RPMI1640培養液中，T24細胞以1×105個/孔的密度將細胞分種于6孔培養板，并置于37℃，5%CO2及飽和濕度的孵箱中培養，將pSilence-Med-19-siRNA轉染入T24細胞，轉染前細胞密度為60%～75%，濃度為60nmol/L，孵育72h。

1.4 半定量PCR 利用Trizol Reagent將各實驗組的T24細胞提取總RNA，紫外分光光度計準確定量。取3μg總RNA進行逆轉錄。Med-19上游引物：5'-TGACAGGCAGCACGAATC-3'，下游引物：5'-CAGGTCAGGCAGGAAGTTAC-3'，GAPDH 上游引物：5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3'，下游引物：5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'。PCR反應條件為94℃變性4min后，按下列參數循環32次：94℃變性20s，57℃退火40s，72℃延伸40s。最后72℃孵育10 min。

1.5 Western Blot蛋白印跡分析 細胞轉染72h后，收集細胞，利用RIPA細胞裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，并調整待測樣本的蛋白質含量。每孔加20μl的蛋白電泳、轉膜、封閉，將膜放入稀釋的一抗中，溫和振蕩3h后置4℃冰箱中過夜。再溫和振蕩（4℃）2h，回收一抗后在TBST中洗膜30min，中間更換TBST 2～3次，分別將膜置于稀釋的二抗中溫和振蕩lh，后在TBST中洗膜30min，中間換液3～4次。曝光、顯影及定影，用底片掃描儀掃描X線膠片，通過凝膠成像系統（Kodak digital science system dc-120）讀取目的電泳條帶的密度掃描值。

1.6 Transwell-侵襲試驗 采用改良Transwell的Boyden小室，取指數生長期T24細胞以1×105/孔接種于6孔培養板內，孵育12h后分別轉染pSilencer-空載體和pSilencer-Med-19-siRNA載體，繼續培養24h后消化離心，調整細胞密度為4×105/ml，取0.2ml接種至已被Matrigel包被的Transwell小室，并將Transwell小室置于24孔板內，以血清濃度差作為趨化條件：小室內為含5%滅活血清的培養基，下室為含20%滅活血清的培養基。常規培養24h后用棉簽頭擦掉Matrigel膠，予甲醇固定，吉姆薩染色，取膜，封片，鏡檢。400倍光鏡下，計數每膜上下左右中5個隨機不同視野的穿膜細胞數，取均值，每組平行設3個小室。實驗重復3次。

1.7 Transwell-遷移試驗 Transwell小室表面不鋪Matrigel膠，其余步驟與侵襲實驗相同。

1.8 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。計量資料以（s）表示，進行單因素方差分析。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RT-PCR檢測轉染后Med-19基因的表達 利用Western Blotting、RT-PCR檢測Med-19表達水平的變化。如圖1所示：與空白對照組、spSilencer-空載體組對比，pSilencer-Med-19-siRNA載體組的Med-19蛋白、基因表達量均被明顯抑制，降低約83%（P＜0.05），以上結果均重復＞3次。

圖1 pSilencer-Med-19-siRNA顯著抑制Med-19蛋白、基因的表達水平

2.2 降低Med-19表達可抑制T24細胞的遷移能力 Transwell-遷移試驗顯示，在每高倍鏡視野下，空白對照組、spSilencer-空載體組的細胞數目顯著高于pSilencer-Med-19-siRNA載體組（P＜0.05）。見圖2。

2.3 降低Med-19表達可抑制T24細胞的侵襲能力 Transwell-侵襲試驗顯示，在每高倍鏡視野下，Control組、spSilencer-空載體組的細胞數目顯著高于pSilencer-Med-19-siRNA載體組（P＜0.05），提示降低Med-19表達可以明顯抑制膀胱癌T24細胞的侵襲能力。見圖3。

圖2 pSilencer-Med-19-siRNA對T24細胞遷移能力的影響

圖3 pSilencer-Med-19-siRNA對T24細胞侵襲能力的影響

3 討論

膀胱癌是泌尿生殖系統中最常見的惡性腫瘤，約占全身惡性腫瘤的4.6%，大多數膀胱癌為TCC，5年內復發率為50%～70%，并有10%～30%進展為肌層浸潤性膀胱癌，50%～80%的膀胱癌會發生轉移和侵襲，且轉移和侵襲是導致膀胱癌治療失敗的主要原因［1］。從腫瘤生物學角度來看，惡性腫瘤是一種全身性疾病，存在轉移及擴散的特征，因此，局部和整體相結合的綜合治療是腫瘤治療的重要原則［2］。近年來，分子靶向治療膀胱癌已成為臨床科研的熱點，眾多研究試圖尋找治療膀胱癌的特異性靶向分子，但收效甚微，其原因在于目前尚未找到從源頭上真正調控膀胱癌生物學活性的關鍵分子［3］。

Med-19基因為中介因子復合體（Med）的1個亞基，在人體內Med-19基因已被定義為腫瘤相關基因，在胃癌、肺癌、骨肉瘤、腦星型細胞瘤等許多惡性腫瘤組織中都存在高表達，而其來源的正常組織或良性病變則低表達或不表達［4］，其機制可能通過影響原癌基因或者相關細胞因子、信號轉導因子的表達來發揮作用，目前有研究發現，在膀胱癌組織中Med-19的表達陽性率顯著高于正常膀胱黏膜組織，結合膀胱癌臨床病理學特征資料進一步分析發現，在高分級、肌層浸潤性腫瘤、淋巴結轉移、復發腫瘤及腫瘤較大情況下，Med-19基因表達水平均明顯高于相對應組別，提示Med-19基因的表達異常可能參與膀胱黏膜的惡性轉化過程［5］。雙鏈小干擾RNA（siRNA）可以在多種類型的細胞中介導特異性的基因沉默作用，這一現象的發現為深入研究單個基因的功能提供了重要的方法學基礎，從而得到了廣泛的應用［6］。本研究通過構建pSilencer-Med-19-siRNA載體，并轉染膀胱癌T24細胞株。與轉染空載體的T24細胞相比，pSilencer-Med-19-siRNA載體轉染可顯著抑制T24細胞的遷移和侵襲速度，其機制可能與Med-19直接或間接參與和介導了多種信號途徑有關，具體機制需要進一步研究。本研究結果表明，通過特異性下調Med-19基因的表達水平可逆轉膀胱癌細胞的惡性表征。Med-19基因在惡性腫瘤生長、分化、侵襲等方面的表現，為人們從分子水平治療膀胱癌提供新的思維。