坎兒井水產蛋白酶菌株X-34產酶條件及其部分酶學特性研究

加蘇爾·阿不都克里木，努爾古麗·熱合曼

（新疆師范大學生命科學學院，新疆烏魯木齊 830054）

坎兒井“karez”，從漢朝時期開始，在新疆吐魯番等特殊干旱地就已經出現坎兒井，巧妙的利用豐富的地下水資源，古稱“井渠”（鄧正新和胡居紅，2008）。據公開發表的研究資料顯示，69條天然坎兒井水中57%滿足生活飲用水標準，83%適合于農田灌溉用水（林亞，2010）。

蛋白酶是催化蛋白和多肽分子中肽鍵的斷裂，產生肽片段和游離氨基酸的一類酶的總稱。蛋白酶是一種蛋白質，具有蛋白質特殊的4級結構（宋熙熙，2017；Grzonka等，2000；Horton等，1996；Brünger等，1986）。蛋白酶具有較高的穩定性，是一類重要的工業用酶，廣泛分布在動物內臟、植物莖葉、果實和微生物中，目前占據了全球酶制劑市場中蛋白酶銷售額的50%左右（秦艷梅等，2017）。其中來源于細菌的蛋白酶占據了全球市場的20%（郇惠杰等，2013）。

微生物的生長繁殖迅速，培養成本低；微生物分泌的蛋白酶大多數屬于胞外酶類，具有容易分離純化（黃文濤和胡學智，1989）等特點，也被認為是安全微生物（GRAS）；同時對載體的要求不高，易開展基因工程研究（Pop等，2003；Emmert等，1999），且與動植物來源蛋白酶相比，微生物產生的酶水解能力強、速度快、水解產物苦味少，所以在食品等眾多行業得到廣泛應用。

蛋白酶在生物技術、食品工業、釀造工業、飼料工業、洗滌劑工業、制革工業、醫藥工業、日用化學品、紡織及廢物處理等領域也有廣泛應用（Temiz等，2013；Ktari等，2012；Rao等，1998）。蛋白酶可用于提高食品的質地和風味，比如干酪制造、焙烤工業、肉類嫩化等。在食品發酵和釀造時，蛋白酶可分解面粉和谷物中的蛋白質，增加酵母營養，從而促進酵母的繁殖和發酵速度（何林玲等，2014）。隨著對蛋白酶需求的日益增多，提高菌株產酶能力顯得尤為重要，但酶在體外酶制劑開發利用時，易受pH、溫度和酶的變性劑等環境因素影響，因此，研究酶學特征是酶資源開發利用的理論基礎（王俊等，2012）。

蛋白酶參與生物體生理活動和疾病的發生，與生物體中消化和吸收食物蛋白、組織蛋白的酶促降解、血液凝固、溶血功能、消炎、動物血壓調節、細胞分化自溶、生物體的衰老、癌癥轉移和生物活性肽的活化等有密切關系（胡學智，2006）。

1 材料、菌株的分離篩選與蛋白酶活力測定

1.1 樣品采集 2015年6月份從吐魯番市亞爾鄉亞爾村米依木阿吉坎兒井、瓊波斯塔克坎兒井，葡萄鄉英薩村阿吾提坎兒井，葡萄鄉達甫散蓋村的達甫散蓋坎兒井和沙依坎兒井等6條坎兒井采集5份水樣。

1.2 培養基 牛肉膏分離培養基，產蛋白酶菌株篩選培養基（陳國參等，2013；張銳等，2001），初始產蛋白酶培養基（陳顯玲，2014）。

1.3 菌株的分離純化 從坎兒井水樣為實驗材料按常規稀釋涂布法進行分離菌株，用線法進行純化并保藏（柯野等，2015；李國娟等，2009）

1.4 產蛋白酶菌株的篩選 將已分離純化的76株菌株用點種法接種在蛋白酶產生菌篩選平板上，37℃培養5 d，菌落周圍有透明圈出現的為陽性，為蛋白酶產生菌。

1.5 蛋白酶活力測定 采用文獻（金玉蘭和王玉榮，2014；魏群，2009）方法測蛋白酶活。以2%酪蛋白（0.05moL/L Tirs-HCL緩沖液，pH=8）為底物，將粗酶液和底物溶液分別置于37℃保溫10 min后，準確吸取 1000 μL底物溶液與1000 μL適度稀釋的粗酶液充分混勻，在溫度37℃下振蕩反應1 h后，加入2000 μL終止液（三氯乙酸18 g/L，乙酸20 g/L，醋酸鈉18 g/L）終止反應，靜置15 min，離心取上清液，用紫外分光光度計測定280 nm處吸光值，以0.05 mol/L Tirs-HCL 緩沖液為空白，采用37℃恒溫振蕩前添加終止液的反應管對照，測定酶活。酶活計算公式：

酶活力（U/mL）=△ A280×1000×n

式中：△A為反應液吸光度值-對照液的吸光度值；n為樣品的稀釋倍數。

酶活單位定義：在一定條件下，每分鐘粗酶液中的蛋白酶水解底物酪蛋白使△A280增加0.001個單位所需要的酶量1個蛋白酶活力單位，以U/mL表示。

1.6 試劑與儀器 2800UV/VIS 型紫外分光光度計（龍尼柯（上海）儀器有限公司），722型可見光分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司），搖床TS-211F（上海天呈實驗儀器制造有限公司），酪蛋白（中國醫藥上海試劑站），Yeast Extract（Oxoid公司產品），葡萄糖（上海化學試劑分裝廠）等主要藥品均為分析純。

2 實驗方法和結果

2.1 產蛋白酶菌株的篩選 已分離純化的76株菌株中篩選出一株產蛋白酶活性較高的X-34菌株。將菌株點種法接種于脫脂牛奶平板培養基上，37℃培養5 d后，X-34菌株形成的產蛋白酶透明圈與菌落直徑比值較大，X-34菌株的產蛋白酶透明圈直徑為50 mm，菌落直徑為14 mm。因此，選擇X-34菌株作為后續實驗對象。

2.2 菌株鑒定 將菌株X-34鑒定按文獻（東秀珠等，2001；布坎南等，1984）進行。菌株能形成乳白色緣毛狀菌落，具有菌體桿狀，G+，能產生蛋白酶、淀粉酶、氧化酶、過氧化氫酶等產酶特性，能形成芽孢；芽孢位于菌體中央。可形成根狀菌落和菌膜，最適生長溫度為37℃、能生長于3%氯化鈉濃度的培養基上和pH7.5時生長最好，呼吸代謝類型等特征。根據X-34菌株的菌體和菌落特性、生理生化實驗結果和16s rRNA基因序列分析結果，鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

2.3 發酵粗酶液的制備 量取X-34菌株種子液10 mL，接種于含90 mL發酵培養液的三角瓶中，震蕩培養72 h，取10 mL培養液6000 r/min離心10 min，收集上情液并冰箱保存備用。

2.4 產蛋白酶產生菌X-34的產酶條件

2.4.1 發酵時間對X-34菌株產蛋白酶的影響將菌株X-34種子液按10%的比例接入到產蛋白酶培養液中，置于37℃，搖床180 r/min，培養12、24、36、48、60 h時測酶活力（結果見圖 1）。結果表明，產蛋白酶菌株X-34發酵時間48 h時，蛋白酶酶活力達到1547 U/mL，所以該菌株的最佳發酵時間為48 h。

圖1 培養時間對X-34菌株產酶活性的影響

2.4.2 溫度對產蛋白酶菌株X-34產酶的影響將產蛋白酶菌株X-34種子液接種于5份產酶培養液后，在溫度分別為 20、25、37、40℃的條件下，180 r/min振蕩培養48 h，測定酶活力（結果見圖2）。實驗結果顯示，產酶菌X-34發酵溫度為37℃時，蛋白酶活力達到1538 U/mL，該菌株最佳發酵溫度為37℃。

圖2 發酵溫度對X-34菌株產酶活力的影響

2.4.3 初始pH對產蛋白酶菌株X-34產酶的影響 菌株X-34的種子液和初始pH分別為6，6.5，7，7.5，8的產酶培養液中按1∶10的比例加入后，37℃振蕩速度180 r/min的條件下培養48 h，測定酶活力（結果見圖3）。結果可以看到，產酶菌X-34發酵初始pH為7時，蛋白酶活力達到1543 U/mL，所以該菌株最適發酵初始pH為7。

圖3 初始pH對X-34菌株產酶活性的影響

2.4.4 裝液量對菌株X-34產酶的影響 按無菌操作要求，準確量取菌株X-34的種子液2、4、6、8、10 mL，分別加入于裝 18、36、54、72、90 mL產酶培養液的250 mL錐形瓶內，初始pH為7，在37℃，180 r/min速度振蕩培養48 h，測定酶活力（結果見圖4）。結果顯示，裝液量為80 mL時，產蛋白酶活力達到1532 U/mL。

圖4 裝液量對X-34菌株產酶活性的影響

2.4.5 金屬離子對菌株X-34產酶活性的影響將菌株X-34種子液按10%的比例分別加含0.05%金屬離子 Na+、Ca2+、Mg2+、Al3+、Fe3+的產酶培養液中，在37℃，pH 7，180 r/min速度的條件下振蕩培養48 h，測定酶活力（結果見圖5）。結果顯示，培養基含 Na+、Ca2+、Mg2+、Al3+時，菌株X-34的產蛋白酶活性不同程度的下降，培養基含Fe3+時產酶活性影響不大。

圖5 金屬離子對X-34菌株酶活的影響

2.4.6 碳源對菌株X-34產酶活性的影響 菌株X-34種子液按培養基10%的比例接種到碳源濃度為1%葡萄糖和1%麥芽糖，1%淀粉，1%蔗糖，1%乳糖代替葡萄糖作為唯一碳源的培養基中，在37℃，pH 7，振蕩速度為180 r/min的條件下振蕩培養48 h，測定酶活力（結果見圖6）。結果顯示，菌株X-34的最適碳源為葡萄糖。

圖6 碳源對雙重產酶菌X-34菌株產酶活性的影響

2.4.7 氮源對菌株X-34產酶活性的影響 菌株X-34的種子液按10%的比例分別加入含1%牛肉膏，1%胰蛋白胨，1%硝酸鈉，1%硝酸鉀，1%尿素代替1%蛋白胨作為氮源的培養基中，以葡萄糖為唯一碳源，37℃，pH 7，振蕩速度180 r/min的條件培養48 h，測定酶活力（結果見圖7）。X-34菌株的最適氮源為牛肉膏，其次為蛋白胨。

圖7 氮源對X-34菌株產酶活性的影響

2.5 菌株X-34產生的蛋白酶部分酶學特性 微生物細胞繁殖過程中可以產生胞外酶和胞內酶，菌株X-34產生的蛋白酶是胞外酶。微生物發酵液中提取胞外酶的一般方法是將菌株培養液，離心除菌體，收集上清液，接著用鹽析，透析，最后保存于緩沖溶液中（Fuji等，1983）。影響蛋白酶活力的因素很多，比如酶濃度、底物濃度、溫度、pH、激活劑和抑制劑等。本文中報道菌株X-34產生蛋白酶的最適反應溫度和最適反應pH。

2.5.1 反應溫度對蛋白酶活力的影響 應用50 mmol/L，pH7.2的磷酸鹽緩沖溶液適當稀釋粗酶液后，在最適pH條件下分別在30、32.5、35、37.5、40、42.5、45、47.5、50、52.5、55℃ 等 不 同 溫度下測定菌株粗酶液的蛋白酶活力（結果如圖8），結果表明，X-34菌株產生胞外蛋白酶的最適催化溫度為40℃。

圖8 溫度對X-34菌株蛋白酶活力的影響

2.5.2 反應pH對蛋白酶活力的影響 使用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液、碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液、廣泛緩沖液，分別配成酸堿度為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和 9.0的不同緩沖溶液。用不同pH的緩沖液配制2%的酪蛋白溶液并用不同pH的緩沖液適當稀釋粗酶液，并稀釋粗酶液和2%的酪蛋白溶液混合，按文獻（金玉蘭和王玉榮，2014；魏群，2009）方法測酶活（結果如圖9）。結果顯示，X-34菌株的蛋白酶在pH7.0～8時酶活力較高；在pH7.5時酶活達到最高值。確定菌株產生蛋白酶的最適催化pH值為7.5。

圖9 pH對X-34菌株蛋白酶活力的影響

3 結論

各項產酶條件優化實驗結果表明，X-34菌株是產蛋白酶菌株，最適生長溫度和最適產酶溫度為37℃，最佳產酶時間為48 h，最適初始pH為7；裝液量為80 mL，碳源為葡萄糖，氮源為牛肉膏，其次為蛋白胨。在最適產酶條件下發酵時，菌株X-34產生的蛋白酶活力達到1558 U/mL。菌株X-34產生的蛋白酶最適催化溫度為40℃和最適催化pH為7.5。