LncRNA HAGLR表達與前列腺癌預后的相關性分析

向宸輝，劉小勇，陳勝龍，王鵬橋

前列腺癌（PCa）是男性群體中最高發的惡性腫瘤，同時也是發達國家第2大致死性腫瘤[1]。絕大多數的PCa患者可在早期診斷后，實施包括根治性前列腺切除術等治療，可獲得較好的治療效果[2]。然而，仍然存在部分患者術后腫瘤復發的情況，其表現為持續性的前列腺素特異抗原（PSA）的水平持續上升或出現腫瘤遠端轉移。因此，研究與PCa復發有關的分子生物學機制，尋找與PCa復發相關的重要生物標志物，是目前治療PCa的關鍵。

長鏈非編碼RNA（LncRNA）為長度大于200 nt的非蛋白編碼的RNA，其編碼基因廣泛存在于生物基因組中，并在多種基因的調控中發揮重要作用[3-4]。其中，HAGLR是目前研究較多的LncRNA之一，其編碼基因位于2號染色體長臂，屬于HOX基因家族成員，是調控生長發育的重要基因[5]。有研究表明，HAGLR參與腫瘤的發生及轉移過程，并與患者的預后緊密相關，可能作為評估腫瘤患者預后的潛在生物學指標[6-7]。

本次研究采用實時熒光定量PCR技術（qRTPCR），檢測HAGLR在前列腺癌及癌旁組織中的表達差異，并分析HAGLR與患者臨床病例資料和預后的關系，以探討HAGLR與前列腺癌發病的相關性及其作為前列腺癌患者預后生物標記物的可能。

1 資料與方法

1.1 資料來源 收集2009年1月～2011年12月于筆者科室行手術切除并保存的PCa組織和配對瘤旁正常前列腺組織標本共96份，以及患者的臨床病例資料，包括年齡、Gleason評分、腫瘤分期、術前血清PSA濃度、內分泌治療情況、術前放療、預后等。所有PCa組織及配對癌旁組織于術中切除后立即放于液氮中速凍，后轉入-80℃保存，用于qRT-PCR逆轉錄聚合酶鏈實驗；患者隨訪時間為術后至2017年12月31日。

1.2 HAGLR表達水平檢測 取100 mg凍存PCa組織或配對瘤旁正常前列腺組織標本，放入研磨器中，加入1 ml Trizol液，研磨后靜置5 min，提取總RNA。取5 μl總 RNA，行瓊脂糖凝膠電泳，以檢測RNA完整性。按照逆轉錄試劑盒（Takara公司）說明書方法，用以合成cDNA，后放于-80℃保存。引物由北京擎科新業生物技術有限公司合成。參考SYBR GreenⅠ（美國Thermo Fisher公司）說明書配制反應體系，取cDNA進行qRT-PCR。qRT-PCR結果解讀：△Ct=樣本 Ct平均值-內參 Ct平均值；△△Ct=△Ct-（陰性對照樣品 Ct平均值-內參 Ct平均值）；2-△△Ct表示基因相對表達量。

1.3 統計學方法應用SPSS 19.0軟件分析數據，計量資料以±s表示比較，采用t檢驗；計數資料以頻數和百分率表示，采用χ2檢驗；Kaplan-Meier法分析生存差異，組間比較采用Log-rank法；Cox回歸分析復發相關因素，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者基本臨床資料 共納入96例PCa患者，平均年齡（63.80±8.79）歲；PSA 濃度＜10 ng/ml者80例、≥10 ng/ml者16例；Gleason評分＜7分者55例，≥7分者41例；8例于術后行內分泌治療，2例術后行放射治療；76.0%患者處于TNMⅠ期。見表1。

患者基本臨床資料（n=96）

表1

2.2 HAGLR表達與患者臨床病例特征的相關性

qRT-PCR檢測結果顯示，腫瘤組織HAGLR表達水平顯著高于癌旁正常前列腺組織（P＜0.01）。見圖1。

2.3 HAGLR表達與患者預后的相關性 Log-rank檢驗結果顯示（圖2），HAGLR的表達水平會影響PCa患者的無復發生存率（RFS）；Cox回歸分析顯示，Gleason評分≥7、TNM分期為Ⅱ～Ⅳ期、HAGLR高表達均是影響PCa患者RFS的獨立危險因素（P＜0.05）。

圖1 PCa及癌旁組織HAGLR檢測結果

圖2 不同HAGLR表達水平PCa患者RFS比較

3 討論

隨著基因組學研究的不斷深入，了解到基因組序列中只有2%的基因被翻譯成蛋白質，而大部分基因被轉錄為非編碼RNA[10]。作為非編碼RNA重要的一環，LncRNA曾被認為是基因組轉錄的噪聲，無生物學功能，但許多研究發現，LncRNA與多種腫瘤密切相關。在肝癌中，LncRNA TSLNC8通過競爭性地與轉酮醇酶（TKT）以及信號傳導與轉錄激活因子3（STAT3）相結合，介導STAT3磷酸化及其編碼基因的轉錄活性，抑制IL-6/STAT3信號通路，從而影響肝癌細胞的增殖[11]。在肺癌中，LncRNA IGFBP4-1通過調控腫瘤細胞的能量代謝過程，影響肺癌細胞的增殖與侵襲能力[12]。這些研究結果表明，LncRNA具有成為腫瘤治療潛在靶點的可能。

HOX基因在腫瘤細胞各種生理過程中發揮著重要的作用，如調控細胞凋亡、受體信號轉導和細胞分化[13]。HAGLR作為HOX基因家族成員之一，同樣參與腫瘤的調控。目前的研究顯示，HAGLR在神經膠質瘤、膀胱癌、胃癌等多種腫瘤中表達上調[6，14，15]。 而干擾 HAGLR 的表達，能顯著抑制腫瘤細胞系的增殖，證明其促癌基因的角色。目前研究發現，其致癌作用存在多種機制，Li等[15]發現，在胃癌細胞系，HAGLR的表達明顯上升，而通過抑制HAGLR表達，發現酪氨酸蛋白激酶2（JAK2）與STAT3的磷酸化水平明顯下降，提示HAGLR通過JAK2/STAT3通路促進胃癌細胞的增殖與遷移。同時有報道[7]，HAGLR可通過調節脂酸合成酶的活性，而誘導非小細胞肺癌（NSCLS）的發生。

本研究發現，PCa腫瘤的HAGLR表達水平顯著高于癌旁組織，推測其與前列腺癌的發生發展過程相關。通過比較不同臨床病例特征患者的HAGLR表達水平，發現HAGLR的表達與Gleason評分（＜7 vs.≥7）、伴或不伴有血管侵犯以及不同TNM分期有關，Gleason評分越高，發生血管侵犯，TNM分期越高，HAGLR的表達水平也明顯增高，而與血清PSA濃度、包膜外侵犯及淋巴轉移無關，提示HAGLR與腫瘤的增殖分化相關。此外，生存分析結果顯示，HAGLR的表達與患者的RFS高度相關，低表達HAGLR的患者的RFS明顯優于高表達HAGLR的患者，表明HAGLR與PCa患者術后復發高度相關。進一步Cox回歸分析顯示，Gleason評分≥7、TNM分期為Ⅱ～Ⅳ期、HAGLR高表達是影響PCa患者RFS的獨立危險因素。以上結果提示，HAGLR可作為判斷PCa患者復發的生物學指標。

綜上所述，HAGLR的表達水平顯著高于癌旁組織，且與PCa患者的預后密切相關；HAGLR可作為評估PCa患者預后的潛在指標，檢測HAGLR有助于PCa早期復發的診斷，對發現PCa的治療新靶點及預后評估方法提供了新思路。