亮菌多糖的單糖組成分析及含量測定方法

蔡晶晶，王雅潔，王 薔，宋小平

(安徽醫學高等專科學校藥學系，安徽合肥 230601)

亮菌因菌絲體能在暗處發出淺藍色的熒光而得名，屬于擔子菌亞門，層菌綱，傘菌目，口蘑科，假蜜環菌屬，為一種藥食兼用的名貴食用菌[1]。亮菌營養豐富，具有良好的藥用價值，具有提高免疫力、抗腫瘤、消炎、抗菌、防輻射等作用。中醫認為亮菌味甘性寒，具有強筋壯骨、疏風活絡、名目利肺、益腸胃等保健功能[2-3]。臨床上常用的亮菌口服液是以亮菌為原材料開發的。亮菌口服液主要成分之一即為亮菌多糖，具有提高免疫功能，抗氧化、抗衰老，預防心腦血管疾病，逆轉酒精導致的肝損傷，促進核酸、蛋白質的生物合成和組織損傷修復等功效[4]。

亮菌多糖含量測定既為亮菌口服液、亮菌糖漿制劑的質控標準之一，也是亮菌多糖活性研究中的基本內容。亮菌多糖成分復雜，由多種單糖組成，由于不同單糖與化學試劑的顯色深度不同，采用不同單糖為標準品繪制的標準曲線的斜率也不同[5]。如葡萄糖、阿拉伯糖顯色最深，甘露糖、木糖較淺，半乳糖、巖藻糖顯色更淺。在測定多糖混合物時，因單糖組成不同造成誤差，導致樣本測定結果因標準品而異，可信度低。本文擬分析亮菌多糖的單糖組成，評估適當的單糖標準品以替代目前國標中的葡萄糖標準品，采用硫酸-苯酚法測定多糖含量，以期得到更為科學的亮菌多糖測定方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200液相色譜儀(美國安捷倫公司)、美譜達UV-1100紫外可見分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)。

亮菌固體發酵菌由合肥誠志生物制藥有限公司提供。單糖標準品鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)、半乳糖(Gal)、木糖(Xyl)、葡萄糖(Glc)、甘露糖(Man)、核糖(Rib)、巖藻糖(Fuc)、葡萄糖醛酸(GlcUA)，半乳糖醛酸(GalUA)標準品均為sigma公司產品；乙腈為色譜純；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮、三氟乙酸、甲醇、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸、磷酸氫二鉀、苯酚等試劑均為國產分析純。

1.2 亮菌多糖的制備

取亮菌固體發酵菌，加水80℃提取2 h，過濾取上清液，減壓濃縮至1/3體積后，加三倍體積95%乙醇，4℃靜置12 h后，3000 rpm離心10 min，棄去上清液，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚各洗滌三次，3000 rpm離心10 min，取沉淀。沉淀用水溶解后，真空冷凍干燥。取適量亮菌多糖凍干粉用水溶解制成濃度為2%的溶液，用Sevag法去除亮菌粗多糖中的蛋白質，共去除5次，再經活性炭脫色，得亮菌多糖溶液，經真空冷凍干燥，凍干粉保存。

1.3 亮菌多糖的組成分析

采取1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生高效液相色譜法測定亮菌多糖組成[6-7]。以鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、核糖、巖藻糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸十種單糖的混合對照品溶液同法處理做對照。精密稱定適量亮菌多糖凍干粉于100 mL錐形瓶中，加入4 mol·L-1的三氟乙酸溶液1.0 mL，置120℃條件下水解120 min。70℃水浴，氮吹儀吹干。向水解干燥后得到的樣品及上述混合對照品溶液中分別加入0.5 mol·L-1的PMP甲醇溶液和0.3 mol·L-1的NaOH溶液各0.5 mL，充分混勻后，水浴70℃，反應30 min。冷卻至室溫后加入0.3 mol·L-1HCl 0.5 mL中和，充分混勻。再加入1 mL氯仿，充分振蕩萃取，去除氯仿層，共萃取三次。水層用0.22 μm的濾膜濾過后，待上機。

2 結果與分析

2.1 色譜條件及結果

色譜條件如下：色譜柱：Thermo C18柱(4.6×250 mm，5 μm)；流動相為0.1 mol·L-1pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液∶乙腈=82∶18(v/v)；流速為1.0 mL/min；柱溫為25℃；進樣量為10 μL；檢測波長為245 nm。

1.Man 2.Rib 3.Rha 4.GlcUA 5.GalUA 6.Glc 7.Gal 8.Xyl 9.Ara 10.FucA.混合標準品的PMP衍生產物HPLC圖；B.亮菌多糖的PMP衍生產物HPLC圖圖1 混合標準品和亮菌多糖的PMP衍生產物HPLC色譜圖

通過與標準圖譜比較發現，亮菌多糖主要由六種單糖組成，結合各標準糖的峰面積，采用外標法計算出亮菌多糖中組成糖的含量分別為：甘露糖9.65%、葡萄糖42.72%、半乳糖25.60%、木糖9.81%、阿拉伯糖6.64%、巖藻糖3.94%。另兩種單糖含量非常低，分別為核糖與葡萄糖醛酸，兩者共占1.64%。

2.2 硫酸-苯酚法測定多糖含量

2.2.1 硫酸-苯酚法測定標準曲線

精密稱取無水萄葡糖(Glc)、甘露糖(Man)、半乳糖(Gal)、木糖(Xyl)、阿拉伯糖(Ara)、巖藻糖(Fuc)各10 mg，加水溶解定容至100 mL，搖勻，即得到0.1 mg·mL-1的標準單糖溶液?；旌蠘藴蕟翁侨芤簞t按照1.3中檢測的各種亮菌單糖的質量組成比例配制成濃度為0.1 mg·mL-1的混合標準單糖溶液。采用硫酸-苯酚法測定[5]，分別精密量取0.1 mg·mL-1的標準糖溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL置具塞試管中，依次添加水至2.0 mL，以2.0 mL水為空白對照。各管加入5%苯酚1 mL，搖勻后，迅速加入濃硫酸5.0 mL，立即搖勻，置40℃水浴中保溫30 min，取出于冰浴中放置5 min，測定490 nm處的吸光值。

主要幾種單糖的標準曲線如圖2所示。

圖2 各種單糖及混合糖的硫酸-苯酚法標準曲線

依據混合糖標準曲線，回歸方程為y=13.134x-0.0332(0.02～0.07 mg·mL-1),相關系數R2=0.9994，方程擬合度良好。從標準曲線及依據不同標準曲線的測定值可以得出，以甘露糖做標準曲線所計算的結果與混合標準單糖最為接近。

2.2.2 不同標準曲線下的亮菌多糖含量

精密稱定1.2中制備的亮菌多糖凍干粉10 mg，蒸餾水溶解定容至100 mL，取出25 mL，再定容至50 mL后做亮菌多糖供試液，該亮菌多糖供試液理論濃度為0.05 mg·mL-1。

取亮菌多糖供試液2 mL，參照2.2.1標準曲線中檢測方法，采用不同標準品計算得到的多糖濃度與供試液理論濃度0.05 mg·mL-1的比值如表1所示。

表1 不同標準品制作標準曲線測得亮菌多糖含量結果

2.2.3 精密度實驗

取0.1 mg·mL-1的混合標準單糖溶液稀釋兩倍后，取出2 mL，參照2.2.1標準曲線中檢測方法，連續測定6次，結果RSD為0.22%。

2.2.4 重復性實驗

取2.2.2中亮菌多糖供試液6份，每份2 mL，參照2.2.1標準曲線中檢測方法，考查方法的重復性。結果RSD為1.72%，表明方法重復性良好。

2.2.5 穩定性考查

取2.2.2中亮菌多糖供試液3份，每份2 mL，參照2.2.1標準曲線中檢測方法，分別在反應結束后的10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、90 min、120 min、150 min進行490 nm處吸光度的測定，RSD值分別為0.97%、1.12%、1.54%，表明數值在150 min內穩定。

2.2.6 回收率實驗

以混合標準單糖為對照，硫酸-苯酚法測定亮菌多糖的含量。取亮菌多糖溶液樣本適量與混合標準單糖按表2所示的量混合，不足部分用水補充體積至2 mL，參照2.2.1標準曲線中檢測方法，測定含量，計算回收率。結果平均回收率為102.38%，RSD為2.73%。

表2 回收率實驗結果

3 討論

多糖常用的測定方法有硫酸-苯酚法與硫酸-蒽酮法，經實驗對比發現兩種方法的穩定性、重現性均較好，但相較于硫酸-苯酚法，在應用過程中硫酸-蒽酮法有以下不足：一是反應條件需要煮沸，且所用的硫酸是強腐蝕性試劑，煮沸環節增加了實驗的安全風險和管理風險；二是測定吸光值時，硫酸-蒽酮與糖反應產物附著在玻璃比色皿壁，清洗時需用乙醇浸泡才能去除反應殘留物，這增加了洗滌難度和成本。同時，硫酸-蒽酮法測定的是樣本中所有的碳水化合物，易受樣本中蛋白質等非多糖化合物的干擾，而硫酸-苯酚法用于多種糖類的顯色反應，且基本不受蛋白質雜質的影響，因此用于多糖測定具有更高的專屬性[8-9]。

硫酸-苯酚法來測定亮菌多糖含量原理為多糖會在濃硫酸的作用下水解成單糖，再脫水形成呋喃環結構的糠醛衍生物，糠醛衍生物可與苯酚等物質反應生成有色化合物，因此選擇與樣品的單糖組成相近的標準品對含量測定結果至關重要。而亮菌糖漿制劑大多為亮菌固體發酵多糖制劑，單糖成分復雜，含量尚未見文獻報道，需要進一步研究多糖含量測定方法。

本文采用PMP-HPLC方法測定了亮菌糖漿中的單糖組成，得出其單糖組成主要由葡萄糖(42.72%)、半乳糖(25.60%)、木糖(9.81%)、甘露糖(9.65%)、阿拉伯糖(6.64%)、巖藻糖(3.94%)構成。用HPLC法也可以建立各種單糖的含量測定線性方程，分別測定各個單糖含量，方法可靠但過程繁瑣。本實驗進一步選擇硫酸-苯酚法進行亮菌多糖含量測定，以方便在實驗室批量檢測或工業應用。實驗表明硫酸-苯酚法測多糖含量時在0.02～0.07 mg·mL-1范圍線性關系良好，加標準品的回收率高。

同種亮菌粗多糖樣品，分別采用上述6種含量較高的單糖及按單糖比例組成的混合物為標準品，檢測結果表明，以巖藻糖做標準曲線，測得樣本中多糖含量值大于200%，以半乳糖為標準品則大于100%，以甘露糖為標準品測得值為75.41%，按照單糖組成比例的混合標準品做曲線測得值為74.95%，與以甘露糖為標準曲線的結果基本一致。而以葡萄糖為標準品測得的多糖值最低，為56.24%。因此，采用傳統方法中的葡萄糖作為標準品會低估樣本中的多糖含量。依據亮菌多糖的單糖組成比例制備混合標準品測定總糖含量更為準確，但是混合標準品配制繁瑣，也可用甘露糖作為標準品。用甘露糖或者混合單糖制作標準曲線，結合硫酸-苯酚法可以較為準確地檢測亮菌多糖的含量，實驗結果表明，該法的重復性好、精密度高、顏色穩定時間長，測定亮菌多糖含量準確、可靠。