山竹皮中花青素的提取及純化工藝設(shè)計(jì)

魏 琳，樊 琛，于書(shū)燕，王 會(huì)，鄭煥芹

山竹，屬藤黃科常綠喬木，原產(chǎn)地為馬來(lái)半島和馬來(lái)群島，其果肉多汁清甜，具有“果中皇后”的美譽(yù)。山竹食用后產(chǎn)生的果皮占單果鮮質(zhì)量的52%～68%。山竹皮呈深紫色、性涼、味澀，在泰國(guó)等東南亞國(guó)家一直作為傳統(tǒng)醫(yī)藥[1]，用于治療腹痛、創(chuàng)傷、痢疾等多種疾病。外果皮含有多種具有收斂作用的多酚類物質(zhì)，包括氧雜蒽酮和單寧酸等，這些物質(zhì)可以起到抗菌作用，也可以入藥[2]。山竹皮中富含抑制、鎮(zhèn)靜作用的單寧，而其中含有的花青素既可以作為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑又可以作為防腐劑替代合成防腐劑[3]。研究表明，花青素的抗氧化能力是VE的50倍，VC的20倍，是至今為止發(fā)現(xiàn)的較好的天然抗氧化劑之一[2]。此外，它還具有防癌、防治心腦血管疾病、提高免疫力、改善體循環(huán)和抗衰老等多種功效。近年來(lái)，高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展使得花青素的研究逐漸成為國(guó)內(nèi)外熱點(diǎn)，美國(guó)、歐洲諸國(guó)等相繼開(kāi)發(fā)出與花青素相關(guān)的保健品和藥品，花青素在食品營(yíng)養(yǎng)添加劑、醫(yī)藥保健及化妝品等相關(guān)領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用[4]。

花青素提取制備方法一般采用水提取、有機(jī)溶劑（如乙醇、甲醇等） 提取或采用超聲波提取、酶輔助提取的方法[4-8]。我國(guó)有豐富的山竹資源，山竹皮通常被廢棄處理，以山竹皮為材料，提取其中花青素可以提高山竹皮利用率、提高經(jīng)濟(jì)價(jià)值，也可為花青素的開(kāi)發(fā)提供新的方向[3-4]。故在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交試驗(yàn)[5]對(duì)山竹果皮中花青素提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并通過(guò)大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附進(jìn)行純化，為山竹皮中花青素的開(kāi)發(fā)開(kāi)辟新途徑，實(shí)現(xiàn)廢物資源化利用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

新鮮山竹，購(gòu)于當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)，要求完整、無(wú)蟲(chóng)蛀、無(wú)霉變。山竹皮烘干（55℃，2 d）至山竹皮質(zhì)量達(dá)恒質(zhì)量后粉碎，凍入冰箱，以備后期提取使用。

1.1.2 試劑

無(wú)水乙醇、鹽酸（36%）、氫氧化鈉、VC、水溶VE、濃硫酸、鹽酸，均為分析純，蒸餾水。

1.1.3 儀器

ZT-150型高速多功能粉碎機(jī)，永康市展凡工業(yè)有限公司產(chǎn)品；DHG-9023A型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；TS-100B型恒溫?fù)u床，上海天呈試驗(yàn)儀器制造有限公司產(chǎn)品；UV-1800型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司產(chǎn)品；FA2004型電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；HH-S型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州翔天實(shí)驗(yàn)儀器廠產(chǎn)品；pH計(jì)，奧豪斯儀器（上海）有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 山竹皮花青素提取

取0.5 g山竹皮粉末，在適宜的提取溫度、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)條件下，水浴保溫提取一定時(shí)間，取出過(guò)濾，定容至25 mL，于波長(zhǎng)530，620，650 nm處測(cè)其吸光度[5-7]，并計(jì)算花青素提取量。

（1）花青素光密度計(jì)算。

（2）花青素提取量計(jì)算。

式中：E——花青素提取量，nmol/g；

ε——花青素摩爾消光系數(shù)，4.62×104；

V——試樣定容體積，mL；

Aλ——上式光密度；

m——試樣質(zhì)量，g。

1.2.2 花青素提取單因素試驗(yàn)

（1） 提取溫度對(duì)花青素提取量的影響。稱取5份0.5 g的山竹皮粉末，按料液比1∶40（W∶V）加入60%鹽酸乙醇水溶液，于35，50，65，75，85℃的水浴鍋中保溫提取1 h，過(guò)濾后定容至25 mL，測(cè)其吸光度。

（2）料液比對(duì)花青素提取量的影響。量取60%鹽酸乙醇水溶液20 mL，按料液比1∶10，1∶20，1∶40，1∶60，1∶70（W∶V） 的比例分別加入2.00，1.00，0.50，0.33，0.25 g山竹皮粉末于65℃水浴鍋保溫提取1 h。過(guò)濾后定容至25 mL，并測(cè)其吸光度。

（3）乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)花青素提取量的影響。稱取5份0.5 g的山竹皮粉末，按料液比1∶40（W∶V）分別加入0，20%，40%，60%，80%的鹽酸乙醇水溶液，于65℃水浴鍋中保溫提取1 h。過(guò)濾后定容至25 mL，并測(cè)其吸光度。

（4）提取時(shí)間對(duì)花青素提取量的影響。稱取5份0.5 g的山竹皮粉末，按料液比1∶40（W∶V） 加入60%鹽酸乙醇水溶液，然后將錐形瓶放入65℃的水浴鍋中分別保溫提取0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，10.0，12.0 h，過(guò)濾后定容至25 mL，并測(cè)其吸光度[8-11]。

1.2.3 花青素提取正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)[12-13]，以提取溫度、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間4個(gè)因素的3水平為試驗(yàn)變量，以提取液的花青素提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定山竹皮花青素最佳提取工藝。

1.2.4 大孔樹(shù)脂的篩選

選擇4種大孔樹(shù)脂D101，X-5，AB-8，HPD-750作為試驗(yàn)吸附樹(shù)脂[14-18]。準(zhǔn)確稱取處理過(guò)的不同型號(hào)的大孔樹(shù)脂1 g，分別加入10 mL已知吸光度A1的花青素粗提液，密封，于25℃，以轉(zhuǎn)速100 r/min振蕩24 h，充分吸附后，過(guò)濾，用pH值1.0蒸餾水洗脫除去水溶液雜質(zhì)，并于波長(zhǎng)530 nm處測(cè)濾液吸光度A2；向大孔樹(shù)脂中加入pH值1.0的體積分?jǐn)?shù)60%乙醇10 mL，于25℃條件下密封，以轉(zhuǎn)速100 r/min搖床振蕩24 h，充分解析后過(guò)濾，于波長(zhǎng)530 nm處測(cè)濾液的吸光度A3。根據(jù)相應(yīng)的公式計(jì)算吸附率和解析率。

式中：V1——提取液初始體積，mL；

V2——吸附后濾液體積，mL；

V3——解析后體積，mL。

1.2.5 大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附及解析研究

（1）花青素粗提液的濃度對(duì)吸附量及吸附率的影響。根據(jù)吸附率和解析率，稱取5份1.0 g樹(shù)脂，濾紙吸干置于錐形瓶中，取一定量粗提液，稀釋5個(gè)梯度，其他步驟同1.2.4，計(jì)算吸附量和吸附率。

（2） 大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附時(shí)間對(duì)吸附量的影響。吸附時(shí)間1，3，6，9，18，24 h，其他步驟同1.2.4，計(jì)算吸附量和吸附率。

（3） 大孔樹(shù)脂靜態(tài)解析時(shí)間對(duì)解析量的影響。解析時(shí)間1，3，6，9，18，24 h，其他步驟同1.2.4，計(jì)算解析量。

（4）乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)解析量的影響。解析液選擇30%，45%，60%，75%，90%的乙醇，其他步驟同1.2.4，計(jì)算解析量[19-21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)對(duì)山竹皮花青素的影響

2.1.1 提取溫度對(duì)山竹皮花青素的影響

取山竹皮粉末0.5 g，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶40（W∶V），分別于35，50，65，75，85℃提取溫度下提取1 h。

提取溫度對(duì)山竹皮花青素提取量的影響見(jiàn)圖1。

圖1 提取溫度對(duì)山竹皮花青素提取量的影響

隨著提取溫度的升高，山竹皮中酶等破壞進(jìn)而增加了提取液的穩(wěn)定性，使溶液中可溶性成分的溶解度、擴(kuò)散系數(shù)增大；當(dāng)提取溫度過(guò)高，會(huì)使不耐熱的有效成分受到破壞進(jìn)而失活。提取溫度35～85℃時(shí)，隨著溫度的升高，山竹皮粉末花青素含量逐漸增加。研究表明，長(zhǎng)時(shí)間高溫受熱，花青素易發(fā)生聚合，低于或者等于85℃時(shí)花青素提取程度遠(yuǎn)大于分解程度，但提取的雜質(zhì)含量增高，提取液離開(kāi)水浴環(huán)境后變渾濁，且溫度過(guò)高給后續(xù)操作帶來(lái)困難，故正交試驗(yàn)溫度水平選用65～75℃較合適。

2.1.2 料液比對(duì)山竹皮花青素的影響

量取60%鹽酸乙醇水溶液20 mL，按料液比1∶10，1∶20，1∶40，1∶60，1∶80（W∶V） 的比例分別加入對(duì)應(yīng)質(zhì)量的山竹皮粉末，于65℃溫度下提取1 h。

料液比對(duì)山竹皮花青素提取量的影響見(jiàn)圖2。

圖2 料液比對(duì)山竹皮花青素提取量的影響

一般情況下，只有在料液比較大時(shí)花青素提取效果較好。由圖2可知，溶劑用量達(dá)到一定程度，隨著料液比的減小，花青素提取量減小，而溶液中花青素含量升高，2條折線有1個(gè)交匯點(diǎn)，且料液比過(guò)大會(huì)造成不必要的溶劑浪費(fèi)和能源消耗，故料液比選用1∶25～1∶35。

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)山竹皮花青素的影響

取山竹皮粉0.5 g，按料液比1∶40（W∶V） 分別加入0，20%，40%，60%，80%的鹽酸乙醇水溶液，于65℃溫度下提取1 h。

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)山竹皮花青素提取量的影響見(jiàn)圖3。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)山竹皮花青素提取量的影響

由圖3可知，隨著鹽酸乙醇水溶液中乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，山竹皮花青素的提取量增大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)，達(dá)到最大值，但試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)乙醇體積分?jǐn)?shù)40%時(shí)提取液較渾濁，故判斷處于該體積分?jǐn)?shù)時(shí)有其他物質(zhì)的干擾，經(jīng)過(guò)比較后選擇50%，60%，70%進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)山竹皮花青素的影響

取山竹皮粉0.5 g，按料液比1∶40（W∶V） 加入60%鹽酸乙醇水溶液，分別于65℃的提取溫度提取 0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，10.0，12.0 h。

提取時(shí)間對(duì)山竹皮花青素提取量的影響見(jiàn)圖4。

圖4 提取時(shí)間對(duì)山竹皮花青素提取量的影響

山竹皮中花青素隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，花青素提取量也相應(yīng)增加。由圖4可知，在10 h附近提取率有最大值，而后隨著提取時(shí)間的增長(zhǎng)，花青素提取量逐漸減少。提取時(shí)間較短時(shí)，花青素來(lái)不及溶出；提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，花青素又會(huì)因長(zhǎng)時(shí)間受熱發(fā)生結(jié)構(gòu)的變化，雜質(zhì)成分溶解也隨之增加。故提取時(shí)間選擇在9～11 h。

2.2 花青素提取正交試驗(yàn)

在上述單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化提取時(shí)間、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間對(duì)山竹皮中花青素提取效果的影響，設(shè)計(jì)四因素三水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，即提取溫度優(yōu)化范圍65，70，75℃；料液比優(yōu)化水平1∶25，1∶30，1∶35；乙醇體積分?jǐn)?shù)優(yōu)化范圍50%，60%，70%；提取時(shí)間優(yōu)化水平9，10，11 h。

正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由極差值R分析可知，提取溫度對(duì)試驗(yàn)花青素提取率影響程度最大。4個(gè)因素對(duì)山竹皮中花青素提取效果影響的強(qiáng)弱順序?yàn)樘崛囟龋玖弦罕龋咎崛r(shí)間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)，最優(yōu)提取因素水平為A3B2C2D3，即山竹皮中花青素的最佳提取條件為提取溫度75℃，料液比1∶30，提取時(shí)間11 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%。按照正交試驗(yàn)優(yōu)化的最佳提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)定花青素含量均為2 083.5 nmol/g，故其平均值為2 083.5 nmol/g，高于表3中每一項(xiàng)結(jié)果，故A3B2C2D3為山竹皮花青素的最佳提取工藝。結(jié)果說(shuō)明由正交試驗(yàn)所得到的最佳提取工藝是嚴(yán)謹(jǐn)?shù)模Y(jié)果是準(zhǔn)確的。

在花青素提取試驗(yàn)中，王月囡等人[22]采用水浴法提取發(fā)酵后山葡萄皮中的花青素，確定最優(yōu)條件為提取時(shí)間1 h，提取溫度65℃，料液比1∶20，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%。張曉南等人[2]利用勻漿機(jī)使山竹果皮在乙醇溶液中充分破碎，直接得到提取物中的山竹多酚類物質(zhì)，得出最優(yōu)勻漿時(shí)間為6 min。黃雪松等人[24]用分光光度法，以對(duì)－二甲基氨基肉桂醛（DMAC） 為顯色劑測(cè)山竹殼中原花青素含量，DMAC溶液與兒茶酚反應(yīng)后60 min內(nèi)吸光度測(cè)定顯示二者形成的縮合物吸光度在15～35 min內(nèi)比較穩(wěn)定，適宜測(cè)量。

2.3 大孔吸附樹(shù)脂純化結(jié)果

2.3.1 大孔吸附樹(shù)脂的篩選

選取4種不同的大孔樹(shù)脂分別對(duì)山竹皮花青素進(jìn)行靜態(tài)吸附和解析試驗(yàn)。

4種樹(shù)脂靜態(tài)吸附及解析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 4種樹(shù)脂靜態(tài)吸附及解析結(jié)果

綜合考慮吸附率和解析率2個(gè)因素，得出D101型為最佳純化花青素的樹(shù)脂。因此，選擇D101大孔樹(shù)脂對(duì)山竹皮花青素進(jìn)行吸附和解析試驗(yàn)。

2.3.2 樣品的濃度對(duì)大孔樹(shù)脂吸附率和吸附量的影響

樣品的濃度對(duì)大孔樹(shù)脂吸附率和吸附量的影響見(jiàn)圖5。

圖5 樣品的濃度對(duì)大孔樹(shù)脂吸附率和吸附量的影響

由圖5可知，D101型樹(shù)脂對(duì)山竹皮花青素的吸附量和吸附率在一定的濃度范圍內(nèi)隨樣品濃度的增大而增大；但吸附量隨濃度的變化較小，而吸附率隨濃度的變化明顯。當(dāng)相對(duì)濃度單位為10時(shí)，樹(shù)脂的吸附量達(dá)到最大，約為60 mg/g；當(dāng)樣品的濃度繼續(xù)增大時(shí)，由于樹(shù)脂吸附飽和樹(shù)脂的吸附率反而下降，此時(shí)較高濃度的上樣液會(huì)造成原料的浪費(fèi)，因此在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)控制樣品的相對(duì)濃度單位為10為宜。

2.3.3 平衡時(shí)間對(duì)大孔樹(shù)脂吸附量的影響

平衡時(shí)間對(duì)大孔樹(shù)脂吸附量的影響見(jiàn)圖6。

圖6 平衡時(shí)間對(duì)大孔樹(shù)脂吸附量的影響

由圖6可知，在靜態(tài)吸附過(guò)程的前1 h內(nèi)D101型大孔樹(shù)脂對(duì)山竹皮花青素的吸附量迅速增加。1 h后D101型大孔樹(shù)脂對(duì)山竹皮花青素的靜態(tài)吸附上升并趨于緩慢，由于花青素不穩(wěn)定等因素其吸附量略有下降，因此考慮時(shí)間和花青素降解等因素，選取1 h為吸附平衡時(shí)間。

2.3.4 平衡時(shí)間對(duì)大孔樹(shù)脂解析量的影響

平衡時(shí)間對(duì)大孔樹(shù)脂解析量的影響見(jiàn)圖7。

圖7 平衡時(shí)間對(duì)大孔樹(shù)脂解析量的影響

由圖7可知，在靜態(tài)解析過(guò)程的前1 h內(nèi)D101型大孔樹(shù)脂對(duì)山竹皮花青素的解析量增加明顯。解析時(shí)間在1 h之后，隨著解析時(shí)間的增加，D101大孔樹(shù)脂對(duì)山竹皮花青素的靜態(tài)解析上升趨于緩慢，1 h后基本解析完全，由此，確定1 h為解析平衡時(shí)間。

2.3.5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)大孔樹(shù)脂解析量的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)大孔樹(shù)脂解析量的影響見(jiàn)圖8。

圖8 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)大孔樹(shù)脂解析量的影響

由圖8可知，在乙醇體積分?jǐn)?shù)30%～60%，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，花青素的解析量隨之減少；在60%之后，解析量隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增大，在75%時(shí)達(dá)到最大值，大約為25 mg/g，之后隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而降低，因此，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%時(shí)對(duì)大孔樹(shù)脂的解析效果最好。

因此選擇D101型樹(shù)脂，在相對(duì)濃度單位為10，吸附解析平衡時(shí)間均為1 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%時(shí)，吸附量為60 mg/g，解析量為25 mg/g。Liu T X等人[25]從山楂中提取原花青素后，用LSA-10型大孔樹(shù)脂純化粗提液，上樣質(zhì)量濃度為14.8±0.08 mg/mL，流速為2 BV/h，洗脫液為50%乙醇溶液，洗脫速度為1 BV/h，經(jīng)純化后的原花青素純度可達(dá)83.2%。大孔樹(shù)脂來(lái)源廣泛種類較多，可以提高純化效率且重復(fù)利用，降低試驗(yàn)成本。但大孔樹(shù)脂也存在一定的缺陷,如大孔樹(shù)脂需經(jīng)過(guò)酸泡、堿泡等一定前處理才能使用，且經(jīng)大孔樹(shù)脂純化后的花青素純度不高，還需進(jìn)行進(jìn)一步純化處理。試驗(yàn)中選擇從4種常用大孔樹(shù)脂中挑選效果最明顯的一個(gè)進(jìn)行純化試驗(yàn)，并通過(guò)變化樣品濃度，靜態(tài)平衡解析、吸附時(shí)間，乙醇濃度確定最優(yōu)條件。

3 結(jié)論

以山竹皮為原料通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定山竹皮中花青素最優(yōu)提取工藝為提取溫度75℃，料液比1∶30，提取時(shí)間11 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，花青素提取量為2 083.5 nmol/g。其中，提取時(shí)間、提取溫度、料液比及乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)花青素的提取量分別具有不同程度的影響，其中以提取溫度對(duì)提取過(guò)程的影響最為顯著，強(qiáng)弱順序?yàn)樘崛囟龋玖弦罕龋咎崛r(shí)間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)。

采用D101型大孔樹(shù)脂吸附純化，當(dāng)樣品相對(duì)濃度10，解析時(shí)乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%，靜態(tài)吸附解析時(shí)間均為1 h時(shí)，吸附量60 mg/g，解析量25 mg/g。其中樣品濃度，靜態(tài)平衡解析、吸附時(shí)間，乙醇體積分?jǐn)?shù)均對(duì)山竹皮花青素的純化有較大的影響。