中華獼猴桃根三萜類化合物雙水相超聲提取工藝及抗癌活性分析

趙紅巖

中華獼猴桃（Actinidia chinensis Planch.），又名藤梨、羊桃藤等，是中國特有的藤本果種，因其渾身布滿細小絨毛，很象桃，而獼猴喜食，故有其名（李時珍《本草綱目》）。中華獼猴桃根又稱藤梨根。藤梨根性寒、味苦，可清熱解毒、活血消腫、祛風利濕，常用于風濕性關節炎、跌打損傷、絲蟲病、肝炎、痢疾、淋巴結結核、癰癤腫毒、癌癥等?，F代研究表明，其根中含三萜類、黃酮類、蒽醌類、酚類及其他多種活性成分，其中以三萜類成分為主[1-2]?，F代藥理研究發現，獼猴桃根具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化等藥理作用[3-5]。

目前，國內對于植物中三萜類成分提取的方法主要有溶劑提取法、超臨界CO2提取法、超聲波提取法、雙水相提取法等。溶劑提取法主要是利用有機溶劑對原料中的三萜成分回流提取，此提取方法簡單方便、生產的一次性投入較低，但此過程中成分損失較大、周期長且提取效率較低。超臨界CO2提取技術具有高效、安全、幾乎無毒等特點，但其設備的一次性投入較大、生產技術工藝不夠完善。超聲波提取技術是利用超聲波產生空穴效應增強細胞膜的通透性，將原料中的三萜成分提取到溶劑中，具有提取效率高、提取時間短、節能等優點，目前廣泛應用于藥物活性成分的提取領域。雙水相萃取技術是利用物質在雙水相體系中的選擇性分配進行分離，此提取工藝具有設備簡單、操作條件溫和、高效安全等特點。試驗采用雙水相提取和超聲波提取相結合的方法，采用正交試驗法考查提取中性鹽的質量濃度、有機溶劑體積分數、超聲時間和料液比4個因素對中華獼猴桃根中三萜類化合物提取率的影響。同時，考查了三萜類提取物對3種腫瘤細胞的抑制活性。

1 試驗部分

1.1 試劑與儀器

齊墩果酸標準品（純度99.5%），中國藥品生物檢定所提供；香草醛、冰醋酸、異丙醇、硫酸銨、高氯酸，西安化學試劑廠提供；噻唑藍（MTT）、胎牛血清（FBS）、二甲基亞砜（DMSO）、DMEM培養基，北京西美杰科技有限公司提供；人胃癌細胞株（SGC7901）、人肝癌細胞株（Bel-7402）、人結腸細胞株（SW620），中國醫學科學研究院腫瘤細胞庫提供。

UV1901型紫外-可見分光光度計，上海奧析科學儀器有限公司產品；HBS-1096A型酶聯免疫檢測儀，南京德鐵實驗設備有限公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 三萜類化合物提取工藝條件的確定

取干燥的中華獼猴桃根粉碎，過40目篩，置于提取器中，以不同的硫酸銨質量濃度（A）、異丙醇體積分數（B）、不同的超聲時間（C） 和料液比（D）為參數，考查其對三萜類化合物提取率的影響。以香草醛-冰醋酸-高氯酸分光光度法測定三萜類化合物的含量[6]。按下述公式計算三萜類化合物的提取率。

式中：C——三萜類物質的質量濃度，mg/mL；

V——提取液的定容體積，mL；

M——樣品質量，mg。

正交試驗因素與水平設計見表1。

表1 正交試驗因素與水平設計

1.2.2 MTT法評價各種衍生物的抗腫瘤活性

采用MTT法測試所合成的衍生物對人胃癌細胞株（SGC-7901）、人肝癌細胞株（Bel-7402） 和人結腸癌細胞株SW620的體外生長增殖抑制活性。

試驗步驟如下：①收集對數期生長狀態良好的癌細胞，加入20%的胰蛋白酶消化液，制成細胞懸液，并將細胞密度控制在5×104個/mL。②取細胞懸液接種于96孔板上，200 μL/孔，采用DMEM培養基（加入10%胎小牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素），置于CO2恒溫培養箱中于37℃條件下培養24 h。③換液，按預設的質量濃度梯度（最大為100 mg/mL） 加入待測樣品,每孔50 μL，每個質量濃度梯度下設計5個平行孔，同時以等量的DMSO進行空白對照試驗；置于CO2恒溫培養箱中于37℃條件下培養48 h。④離心后棄去培養液，小心用PBS緩沖液沖洗3遍后，再加入含MTT（5 mg/mL）的培養液，然后在CO2培養箱中繼續溫育4 h。⑤吸去上清液，每孔加入150 μL DMSO，置于搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。用酶聯免疫檢測儀于波長493 nm處測量各孔的吸光度（OD值）。得到的結果采用下列代入式計算各物質對腫瘤細胞生長的抑制率。

以抑制率為縱坐標、以衍生物的質量濃度為橫坐標作圖，求出每個衍生物的IC50值。

2 結果與分析

2.1 正交試驗

正交試驗結果分析見表2。

表2 正交試驗結果分析

由表2可知，影響中華獼猴桃根中三萜類物質提取率因素的主次順序為超聲時間＞料液比＞硫酸銨質量濃度＞異丙醇體積分數。正交試驗的最佳組合為A3B1C1D2，即硫酸銨質量濃度0.18 g/mL，異丙醇體積分數40%，超聲時間30 min，料液比1∶9。

2.2 驗證試驗

因確定的提取三萜類物質最佳工藝條件不在正交試驗的9個組合中，為了考查最優條件的重現性進行驗證試驗。采用最佳提取工藝條件A3B1C1D2，重復5次試驗過程，計算得出中華獼猴桃根三萜類物質的提取率為6.78%±0.03%。試驗結果表明，在上述條件下三萜類物質的提取率相對穩定，能達到優化的目的。

2.3 衍生物的抗腫瘤評價與分析

采用MTT法測定三萜類化合物對3種腫瘤細胞的抑制活性，計算抑制率。

三萜類化合物對3種腫瘤細胞的抑制率見表3。

表3 三萜類化合物對3種腫瘤細胞的抑制率

由表3可知，中華獼猴桃根中的三萜類化合物對胃癌細胞株、肝癌細胞株、結腸癌細胞株均有一定的抑制活性。其中，對胃癌細胞株抑制活性最為突出，抑制率為38.1%，當三萜類化合物質量濃度為80 mg/mL時，抑制率既已超過50%，且抑制率隨物質質量濃度增加而增加。

3 結論

三萜類化合物是中華獼猴桃根中主要活性物質。試驗中采用硫酸銨和異丙醇組成的雙水相系統，并結合超聲波提取確定最佳提取工藝條件為硫酸銨質量濃度0.18 g/mL，異丙醇體積分數40%，超聲時間30 min，料液比1∶9。雙水相提取與超聲波提取相結合提取三萜類物質的工藝過程與傳統的提取技術相比，工藝條件更為溫和，三萜類物質更易于分離。將提取得到的三萜類化合物采用MTT法分析其抗腫瘤活性。結果表明，中華獼猴桃根中的三萜類物質對所選的3種腫瘤細胞均有一定的抑制活性，尤其是對胃癌細胞的抑制活性最為顯著。