小鼠骨髓中性粒細胞分離純化及活性檢測研究

楊 琳 田 蕾 周 璇 楊 樂 李麗英

(首都醫科大學細胞生物學系， ‘肝臟保護和再生調節’北京市重點實驗室，北京 100069)

中性粒細胞是體內重要的固有免疫細胞，來源于骨髓中的造血干細胞，在骨髓中分化發育完畢后進入血液，參與炎性反應，有利于機體的免疫防御，但其參與的炎性反應也會對機體組織產生損傷[1-3]。中性粒細胞是循環系統中含量最豐富的白細胞，它不僅是機體防御外源病原體入侵的第一道防線，也是參與體內免疫調節的重要細胞[4]。當機體發生感染或者炎性反應時，中性粒細胞能夠迅速遷移至炎性反應局部組織殺菌，完成了使命的中性粒細胞啟動自發凋亡，保證一些具有細胞毒性的物質不會被隨意地釋放到組織中，引起不必要的組織損傷，最終凋亡的細胞被周圍的巨噬細胞所吞噬清除[5]。故針對中性粒細胞的功能研究越來越受關注。但是，這一相關研究工作開展的前提是分離純化出有活性的小鼠骨髓中性粒細胞。

目前文獻[6-8]報道的分離人或動物的中性粒細胞的方法眾多，常用的有密度梯度離心法、Dextran作用下紅細胞自然沉降法、免疫磁珠等方法，Dextran作用下紅細胞自然沉降法的回收率比較低，免疫磁珠分選的中性粒細胞存在一定的局限性。密度梯度離心法是根據細胞本身的比重差別來分離各種細胞的方法，其中最常用的是Percoll非連續密度梯度離心法，其原理是利用一種密度介于1.075～1.092 g/mL之間、且近于等滲的溶液做密度梯度離心，使一定密度的細胞按相應密度梯度分布，從而將各種細胞加以分離，但是該方法的試劑配制比較繁瑣，而且分離得到的細胞形態與原始形態有差異[8]。

本課題擬優化分離純化、鑒定及活性檢測小鼠骨髓中性粒細胞的方法，根據細胞的密度不同的特點，加入Histopaque?-1077和Histopaque?-1119(兩種市售的不同密度梯度的等滲溶液)來分離中性粒細胞，將收集的中性粒細胞加入抗Ly6G(中性粒細胞的標志蛋白)抗體孵育[9]，用高內涵篩選和分析儀檢測，加入佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate， PMA)刺激后用高內涵篩選和分析儀鑒定其活性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1)動物：ICR小鼠(10只雄性)，SPF級，體質量28～30 g，5～6周齡，購于首都醫科大學實驗動物部，實驗動物許可證號： SYXK(京)2015—0012。

2)主要儀器：離心機(德國 Eppendorf 公司 5810R)，細胞培養箱(150i，美國 Thermo 公司)，高內涵篩選和分析儀(Cell Insight,美國 Thermo Fisher 公司)。

3)主要試劑：Histopaque?-1077、Histopaque?-1119 (美國 Sigma 公司)， Ly6G 抗體 (美國 BD 公司)，髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)抗體(美國 Abcam 公司)，FITC羊抗兔抗體(美國 Jackson Immunoresearch 公司)，Cy3羊抗兔抗體(美國 Jackson Immunoresearch 公司)，DAPI(瑞士Roche 公司)，人纖連蛋白(美國Calbiochem 公司)，PMA(美國 Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠骨髓中性粒細胞分離純化及活性檢測流程

用Histopaque?-1077、Histopaque?-1119分離小鼠骨髓中性粒細胞流程圖 (圖1)。

1.2.2 小鼠中性粒細胞分離方法

脫臼處死ICR小鼠，無菌分離其脛骨和股骨，剝離結締組織及肌肉，置于0.9%(質量分數)氯化鈉注射液中，用直剪剪去骨頭兩端，暴露骨髓腔，用1 mL注射器(針規格 0.45×16)吸取0.9%(質量分數)氯化鈉注射液沖洗骨髓腔，并將沖洗液用 70 μm 的尼龍濾網過濾到50 mL離心管中，1 200 g離心5 min收集細胞，用 3 mL 0.9%(質量分數)氯化鈉注射液重懸，將細胞懸液置于 9 mL Histopaque?-1077 上，4 ℃ 2 000 g無制動離心20 min，棄上清，用 5 mL 0.9%(質量分數)氯化鈉注射液重懸細胞，將細胞懸液置于10 mL Histopaque?-1119 上，4 ℃ 2 000 g無制動離心20 min，收集中間絮狀層即為中性粒細胞。

1.2.3 小鼠中性粒細胞鑒定

將收集的細胞，加入等量0.9%(質量分數)氯化鈉注射液，1 200 g 離心5 min用200 μL 0.9%(質量分數)氯化鈉注射液重懸細胞，加入200 μL 4%(質量分數) 多聚甲醛固定1 h，用 PBS 洗 3 次，每次 5 min，0.5% PBST[含 0.5%(體積分數)Triton X-100 的 PBS]破膜 15 min，用 PBS 洗 3 次，每次 5 min，用 2%(質量分數)BSA 37 ℃ 30 min，加兔抗 Ly6G(1∶100)37 ℃ 孵育1 h，用 PBS 洗 3 次，每次 5 min，加山羊抗兔FITC(1∶100)37 ℃ 孵育1 h，用 PBS 洗 3 次，每次 5 min，加DAPI(1∶100)5 min，加入到96孔板中用高內涵分析儀觀察，拍片。

1.2.4 小鼠中性粒細胞活性檢測

使用終濃度5 μg/cm2中人纖連蛋白(fibronectin)包被96孔板，將細胞懸液50 μL(105個)加到包被的板子上，37 ℃ CO2培養箱孵育4 h，將96孔板內的細胞采用數字表法隨機分為實驗組和對照組，實驗組：加100 nmol/L PMA，對照組：加入與實驗組中 PMA相同體積的1640 培養基，37 ℃ CO2培養箱孵育2 h，加入4%(質量分數)多聚甲醛固定1 h，用 PBS 洗 3 次，每次 5 min，0.5%(體積分數) PBST破膜 15 min，用 PBS 洗 3 次，每次 5 min，用2%(質量分數) BSA 37 ℃ 封閉30 min，加兔抗 MPO(1∶200)37 ℃ 孵育1 h，用 PBS 洗 3 次，每次 5 min，加羊抗兔Cy3(1∶100)37 ℃ 孵育1 h，用 PBS 洗 3 次，每次 5 min，加DAPI(1∶100)5 min，用 PBS 洗 3 次，每次 5 min，用高內涵分析儀10×物鏡觀察并拍片檢測小鼠中性粒細胞MPO的表達情況。采用高內涵分析軟件(美國Thermo Fisher公司)分析所獲取的圖像結果，實驗重復3次，將3次結果取平均值進行倍數比較。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 小鼠中性粒細胞的鑒定

將分離純化的細胞用免疫熒光的方法染色，采用高內涵分析儀檢測觀察中性粒細胞的標志物 Ly6G的表達情況。結果顯示細胞 100% 表達 Ly6G (圖2)，說明分離純化的細胞是中性粒細胞。

圖1 提取小鼠骨髓中性粒細胞流程圖Fig.1 Scheme of mouse neutrophils from bone marrow

圖2 小鼠骨髓中性粒細胞標志物的表達Fig.2 Ly6G were expressed in mouse neutrophils from bone marrow

Representative images of neutrophils Ly6G (green) were showed by immunofluorescence.Ly6G(-)：without Ly6G antibody; Ly6G(+)： with Ly6G antibody. Nuclei were stained with DAPI. High Content Screening(20×).

2.2 小鼠中性粒細胞活性的鑒定

用100 nmol/L PMA刺激，檢測 MPO 的表達。結果顯示加入PMA刺激后，中性粒細胞MPO表達增強，實驗重復3次，單次檢測結果詳見圖3A，用高內涵分析軟件(Thermo Scientific Cellomics iDEV Software)分析所獲取的圖像，將3次的熒光強度取平均值進行倍數比較。實驗組的熒光強度是9 052±1 039.16，對照組的熒光強度29 547.67±1 997.33，實驗組是對照組的(3.26±0.22)倍(P<0.05)，詳見圖3B。

圖3 小鼠骨髓中性粒細胞的活性鑒定Fig.3 MPO was expressed in mouse neutrophils from bone marrow

3 討論

中性粒細胞被認為是最先募集到感染部位的免疫細胞，在固有免疫反應中扮演著重要的角色。中性粒細胞是宿主防御過程中的重要環節之一，它在組織器官中發揮著抵抗病原菌的作用，如在動脈粥樣硬化、血管炎、血栓形成、肝損傷等多種疾病中均發揮著重要作用[10-15]。中性粒細胞和它引發的炎性反應在組織損傷過程中也有重要作用，所以中性粒細胞的研究也越來越受關注。本實驗室近期研究關注中性粒細胞在小鼠纖維化模型中的作用，建立一種簡單的分離純化和活性鑒定中性粒細胞的方法是進行研究的第一步。Histopaque?-1077是淋巴細胞分離液，Histopaque?-1119是單個核細胞和粒細胞分離液，本實驗是利用細胞本身的比重差別將二者一起使用來分離中性粒細胞。MPO是中性粒細胞的功能標志和激活標志，又稱髓過氧化物酶，外界刺激可導致中性粒細胞聚集釋放MPO[16]，這是中性粒細胞發揮功能的主要方式之一，因此用 PMA 刺激提取的小鼠骨髓中性粒細胞，檢測 MPO 的表達來鑒定小鼠中性粒細胞活性。與傳統方法比較，本實驗室采用的分離純化的小鼠骨髓中性粒細胞活性以及功能、細胞純度、分離純化效率并未發生明顯改變[17]，但是本分離方法簡便易操作，試劑更規范化，能夠有效地分離并鑒定出有活性的中性粒細胞，為進一步研究中性粒細胞在肝纖維化中的作用奠定基礎。