離體頸動(dòng)脈竇-竇神經(jīng)標(biāo)本灌流與記錄一體化裝置的制備

劉 萍 辛 方 張思韜 黃海霞 王 偉 趙海燕

(1.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系，北京 100069；2. 首都醫(yī)科大學(xué)燕京醫(yī)學(xué)院機(jī)能教研室，北京 101300)

動(dòng)脈竇壓力感受器是減壓反射的第一個(gè)環(huán)節(jié)，主要作用是將血壓變化時(shí)對(duì)血管的牽張刺激轉(zhuǎn)變?yōu)榭上蛑袠袀鲗?dǎo)的電信號(hào)，即機(jī)-電換能作用[1]。然而頸動(dòng)脈竇壓力感受器的機(jī)電換能作用的諸多細(xì)節(jié)并不清楚。目前器官水平研究動(dòng)脈壓力感受器功能的方法有兩種：一種是在體隔離灌流的方法，實(shí)驗(yàn)時(shí)隔離頸動(dòng)脈竇，鉗制頸動(dòng)脈竇內(nèi)壓力，同時(shí)記錄動(dòng)脈血壓變化，進(jìn)而測(cè)定出壓力感受器的功能曲線[2]，另一種方法則是采用離體制備頸動(dòng)脈竇-竇神經(jīng)標(biāo)本，直接觀察頸動(dòng)脈竇內(nèi)壓力變化對(duì)竇神經(jīng)放電的影響[3]。相對(duì)于前一種在體隔離灌流的方法，后一種方法由于減少了其他神經(jīng)體液因素對(duì)血壓的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更能反映壓力感受器本身的功能。本課題組經(jīng)過多年的摸索，研制了一套離體頸動(dòng)脈竇-竇神經(jīng)標(biāo)本灌流與記錄一體化裝置，實(shí)現(xiàn)了對(duì)離體頸動(dòng)脈竇-竇神經(jīng)標(biāo)本血管內(nèi)外灌流的同時(shí)控制竇內(nèi)壓力并同步記錄竇神經(jīng)放電。

1 材料與方法

1.1 離體頸動(dòng)脈竇-竇神經(jīng)標(biāo)本的制備

實(shí)驗(yàn)采用成年家兔，體質(zhì)量1.9～2.7 kg，雌雄不拘。20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氨基甲酸乙酯(5 mL/kg)靜脈麻醉，安置氣管插管。游離頸動(dòng)脈竇區(qū)域和竇神經(jīng)，最后取出的頸動(dòng)脈竇-竇神經(jīng)(carotid sinus-sinus nerve， CS-SN)標(biāo)本，包括頸總動(dòng)脈(長約7 mm)、頸外動(dòng)脈(長約5 mm)、頸內(nèi)動(dòng)脈(長約5 mm，結(jié)扎)和竇神經(jīng)(長約7 mm)。

1.2 標(biāo)本槽的制備與標(biāo)本的固定

利用有機(jī)玻璃板自制標(biāo)本槽(圖1)，標(biāo)本槽包括血管槽(圖1a)和神經(jīng)槽(圖1b)兩部分，整個(gè)標(biāo)本槽被固定在保溫盒中。神經(jīng)槽和血管槽之間被一塊有機(jī)玻璃板(圖1j，厚0.5 mm)分隔開，隔板上有一窄縫(圖1k，寬0.5 mm)，為兩槽間唯一相通的部位。血管槽內(nèi)兩側(cè)各預(yù)置1根不銹鋼插管(外徑1.5 mm)， 分別與標(biāo)本的頸總動(dòng)脈端(圖1n)和頸外動(dòng)脈端連接(圖1o)，由電氣比例調(diào)節(jié)閥推動(dòng)的灌流液，經(jīng)一側(cè)不銹鋼插管進(jìn)入頸總動(dòng)脈到達(dá)頸動(dòng)脈竇區(qū)和頸外動(dòng)脈，再經(jīng)另一側(cè)不銹鋼插管流出，此為血管內(nèi)(竇內(nèi))灌流的途徑。標(biāo)本浸泡在血管槽內(nèi)流動(dòng)的生理溶液中，血管槽另有該液體的入口(圖1e)和出口(圖1f)，提供血管外灌流渠道。血管槽底部靠近隔板窄縫處(圖1k)，置有一不銹鋼絲電極(圖1 m)，作為記錄竇神經(jīng)放電的參考電極。CS-SN標(biāo)本的竇神經(jīng)部分(圖1g)經(jīng)神經(jīng)槽和血管槽間隔板的窄縫(圖1k)進(jìn)入神經(jīng)槽。窄縫由硅酯密封，以隔絕兩槽間液體的流動(dòng)。在神經(jīng)槽底部靠近窄縫(圖1k)2 mm處，安置一個(gè)有機(jī)玻璃小立柱(圖1i，直徑1.5 mm，高2 mm)。一根不銹鋼絲(直徑0.1 mm，長20 mm)從神經(jīng)槽底部向上穿過底板，并從小立柱中心穿出，不銹鋼絲裸露部分長6 mm，懸于神經(jīng)槽內(nèi)，作為記錄電極(圖1h)。不銹鋼絲另一端從神經(jīng)槽底板下引出，與放大器輸入端連接。神經(jīng)槽內(nèi)充石蠟油，覆蓋竇神經(jīng)。

1.3 灌流液、灌流方式及竇內(nèi)壓控制

灌流液成分： NaCl 154 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，CaCl22.2 mmol/L，MgCl21.1 mmol/L，葡萄糖5.5 mmol/L；以HEPES-NaOH(5 mmol/L)調(diào)節(jié)pH值為7.4，持續(xù)以100% O2平衡，灌流液溫度控制在 36～37 ℃。

實(shí)驗(yàn)時(shí)，同時(shí)對(duì)標(biāo)本分別進(jìn)行竇內(nèi)和竇外灌流，兩條途徑灌流液相同。一路對(duì)標(biāo)本表面(竇外)以 1 mL/min勻速灌流(圖1f)，血管槽液體表面覆蓋石蠟油；另一路則由壓力調(diào)節(jié)閥輸出的氣壓推動(dòng)灌流液對(duì)竇內(nèi)(血管內(nèi))進(jìn)行脈動(dòng)式灌流，該路灌流壓由灌流液入口處的調(diào)節(jié)閥控制(圖1q)，并由連于出口處的壓力換能器(圖1p)監(jiān)測(cè)。

實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用計(jì)算機(jī)輸出壓力指令程序化控制壓力調(diào)節(jié)閥(PRE-U，德國Hoerbiger公司)，該閥門進(jìn)而控制高壓純氧(0.15 MPa) 的流量輸出預(yù)定氣壓。此壓力用于推動(dòng)儲(chǔ)液瓶中的灌流液進(jìn)入血管(頸動(dòng)脈竇內(nèi))內(nèi)，同時(shí)鉗制竇內(nèi)壓[4-5]。血管內(nèi)灌流速度為 5 mL/min。血管內(nèi)灌流液出口處安置壓力換能器(YH-4，北京航天醫(yī)學(xué)工程研究所)，用于記錄竇內(nèi)壓。

2 結(jié)果

竇神經(jīng)放電活動(dòng)的記錄：以單極記錄法引導(dǎo)竇神經(jīng)放電。 將制備好的頸動(dòng)脈竇-竇神經(jīng)標(biāo)本如圖1固定于標(biāo)本槽內(nèi)，竇神經(jīng)從血管槽引至神經(jīng)槽。應(yīng)用硅酯將血管槽與神經(jīng)槽間隔板窄縫封嚴(yán)，此為提高信噪比的關(guān)鍵。神經(jīng)放電信號(hào)經(jīng)前級(jí)(A1 402， 美國Axon instrument公司)、后級(jí)(CyberAmp380， 美國Axon instrument公司)放大和濾波，電壓總增益為5 000倍，頻帶300 Hz～10 kHz。放大后的電信號(hào)和竇內(nèi)壓信號(hào)由數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)(Digidata 1440， pClamp 10.0， 美國Axon instrument公司)采集(采樣率為20 kHz)。頸動(dòng)脈竇竇內(nèi)壓信號(hào)與放電信號(hào)同步記錄。圖2表示在一例家兔離體頸動(dòng)脈竇-竇神經(jīng)標(biāo)本上記錄的竇神經(jīng)放電。在波動(dòng)式和逐漸增加的斜坡式灌流壓下，竇神經(jīng)顯現(xiàn)出與竇內(nèi)壓波動(dòng)一致的規(guī)律性壓力依賴性放電活動(dòng)。

圖1 灌流-記錄槽結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic diagram of the perfusion and recording chamber

a： vessel perfusion chamber;b： sinus nerve recording chamber;c，d： entrance and exit of sinus perfusion fluid;e：exit of extravascular perfusion fluid；f： entrance of extravascular perfusion fluid；g： sinus nerve;h： recording electrode;i： an insulating column used to fix the recording electrode in sinus nerve recording chamber;j： a partition between vascular perfusion chamber and sinus nerve recording chamber;k： a narrow gap on the partition allowing sinus nerves to pass through and to be sealed by silicone esters;l： peristaltic pump;m： reference electrode at the bottom of the vessel perfusion chamber;n，o： the ends of the common carotid artery and the external carotid artery were connected to the stainless steel intubation respectively;p： pressure transducer;q： the control valve of the perfusion flow in the sinus;r： the control valve of the extra sinus perfusion flow. The vessel perfusion chamber and the sinus nerve recording chamber are fixed in a heat preservation chamber (not shown)， and the temperature is kept constantly by circulating fluid. The leads of the reference electrode and recording electrode are connected with the input of the amplifier through the bottom plate of the box (not shown).

3 討論

通過離體灌流頸動(dòng)脈竇-竇神經(jīng)標(biāo)本并控制頸動(dòng)脈竇內(nèi)壓力，直接觀察頸動(dòng)脈竇內(nèi)壓力變化對(duì)竇神經(jīng)放電的影響是器官水平研究頸動(dòng)脈竇壓力感受器的重要方法之一[6-8]。本課題組經(jīng)過多年的摸索，研制的這套離體頸動(dòng)脈竇-竇神經(jīng)標(biāo)本灌流與記錄一體化裝置利用一個(gè)帶有小縫隙的薄有機(jī)玻璃板將標(biāo)本槽分為血管槽和神經(jīng)槽。實(shí)驗(yàn)過程中創(chuàng)造性的利用硅脂這種疏水又絕緣的膏狀材料來封閉血管槽和神經(jīng)槽間的縫隙，既保證竇神經(jīng)能從血管槽通過縫隙進(jìn)入神經(jīng)槽，又能起到隔離血管槽和神經(jīng)槽的作用，達(dá)到灌流和神經(jīng)放電記錄同步進(jìn)行，互不干擾。同時(shí)，由于硅脂的疏水性，能避免血管槽中的灌流液滲入神經(jīng)槽，有利于信號(hào)記錄過程中信噪比的提高[9]。

圖2 家兔離體頸動(dòng)脈竇壓力感受器放電活動(dòng)Fig.2 Discharges of baroreceptor in isolated rabbit carotid sinus

The pressure-dependent discharges were recorded from a carotid sinus-sinus nerve specimen. The discharge activity originated from the baroreceptors according to the relationship between the discharge activity and the change of the pressure in the sinus.CSND： carotid sinus nerve discharge;ISP： intrasinus pressure;△1 mmHg=0.133 kPa.

在血管槽設(shè)置了兩條灌流通路，能分別實(shí)現(xiàn)血管內(nèi)、外灌流，便于了解藥物發(fā)揮作用的部位。本裝置可以在血管內(nèi)灌流的出、入口分別安裝竇內(nèi)壓力控制系統(tǒng)和壓力記錄裝置，實(shí)驗(yàn)過程中可以控制竇內(nèi)壓力，并在記錄竇內(nèi)實(shí)際壓力的同時(shí)記錄竇神經(jīng)放電，便于對(duì)竇內(nèi)壓力與竇神經(jīng)放電間的關(guān)系進(jìn)行研究[10]。本研究研制的這套離體頸動(dòng)脈竇-竇神經(jīng)標(biāo)本灌流與記錄一體化裝置，可方便、可靠地實(shí)現(xiàn)對(duì)離體頸動(dòng)脈竇-竇神經(jīng)標(biāo)本血管內(nèi)外灌流，同時(shí)控制竇內(nèi)壓力并同步記錄竇神經(jīng)放電。這套系統(tǒng)對(duì)于研究血管壓力感受器的功能具有重要的應(yīng)用價(jià)值。