馴服進化的力量：酶和結合蛋白的定向進化及噬菌體展示技術2018年諾貝爾化學獎簡介
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曹立雪

(首都醫科大學基礎醫學院醫學遺傳與發育生物學系，北京 100069)

北京時間2018年10月3日下午5時45分(當地時間上午11時45分)瑞典皇家科學院宣布將2018年度諾貝爾化學獎授予弗朗西絲·阿諾德(美國)、喬治·史密斯教授(美國)和格雷戈里·溫特爵士(英國)，以表彰他們在酶的定向進化和多肽(抗體)的噬菌體展示技術研究方面的杰出貢獻。弗朗西絲·阿諾德因研究酶的定向進化而分享一半獎金。喬治·史密斯和格雷戈里·溫特因研究多肽和抗體的噬菌體展示技術而共享另一半獎金(圖1)。

1 獲獎者簡介

弗朗西絲·阿諾德(Frances H. Arnold)于1956年出生在美國匹茲堡，1985年從加州大學伯克利分校(University of Calforni，Berkeley，USA)獲得博士學位，現為加州理工學院化學工程、生物工程和生物化學系教授。1993年,她首次進行了酶的定向進化，酶是催化化學反應的蛋白質。此后，她改進了當時用于開發新型催化劑的常規方法。弗朗西絲·阿諾德獲取了一系列性能優良、對環境無毒無害的酶，被應用于制藥行業和生物燃料等領域。

喬治·史密斯(George P. Smith)于1941年出生在美國康涅狄克州諾瓦克，1970年從哈佛大學(Harvard University, Cambridge, USA)獲得博士學位，現為密蘇里大學生物科學學院榮譽教授。1985年，喬治·史密斯發明了一種被稱為噬菌體展示技術的方法，噬菌體(一種感染細菌的病毒)可用于進化新的蛋白質。

格雷戈里·溫特(Gregory P. Winter)爵士1951年出生于英國萊斯特，1976年獲得英國劍橋大學(University of Cambridge, UK)博士學位，現為劍橋大學MRC分子生物學實驗室榮譽研究負責人。格雷戈里·溫特爵士利用噬菌體展示技術進行抗體的定向進化，目的是生產新的藥物，2002年第一種基于這種方法生產的用于治療類風濕性關節炎、牛皮癬和炎性腸病的新藥——阿達木單抗(Adalimumab)獲得批準上市，從那以后，噬菌體展示技術生產出了可以中和毒素、抵抗自身免疫性疾病和治療轉移性癌癥的抗體。

圖1 2018年諾貝爾化學獎獲得者[1]Fig.1 Laureates of the Nobel Prize in Chemistry 2018

2 酶和結合蛋白的定向進化

在我們生活的星球上有一種神奇而強大的力量伴隨著生命的發生和繁榮——進化。自37億年前地球上出現首批生命以來，幾乎每寸地表中都填滿了不斷對環境做出適應的生命體，比如生長在貧瘠山脊上的地衣，在熱泉中頑強生存的藻類，干燥沙漠中渾身披甲的爬行動物，以及在黑暗的深海中閃閃發光的水母。地球上的生物之所以能存活下去，是因為進化幫它們解決了無數復雜的化學問題。所有生物都可以從周邊環境中提取可用的物質和能量，用它們合成自己所需的獨特化學成分。魚的血液中含有防凍蛋白質，因此它們在極地冰洋中也能暢游無阻；貝類能分泌一種水下分子膠，因此可以牢牢粘附在巖石上。這些化學反應的絕妙之處在于，它們已經被編寫進了我們的基因中，能夠代代相傳、不斷演變?；蛉绻l生了一點兒意外變化，就會改變這種化學反應。有時這會削弱生物體的生存能力，有時則會讓該生物變得更加強大。隨著新的化學反應逐漸出現，地球上的生命也變得愈加復雜。

自地球上的生命出現以來，酶的自然進化就已經存在?；虻耐蛔兒偷鞍踪|進化提高了機體應對在新的環境條件下的適應性。幾千年來，人類通過選擇具有所需特性的生物來繁殖動物和植物。人類已經在定向進化和優化酶及結合蛋白，但是在大部分時間里，人們甚至不知道自己在做什么。酶和結合蛋白的定向進化是建立在分子眼光基礎上的人造程序，它將進化過程轉移到實驗室并加速進化， 該方法依賴于在確定的隨機性水平下蛋白質序列的預期變異與工程篩選及選擇策略相結合。

1984年，Manfred Eigen發表了一篇理論論文[2]，概述了酶的定向進化的可能工作流程。 他認為在大型突變體文庫中尋找罕見的改進型突變體即使不是不可能，也很難。在Eigen的理論工作之后的十年，Frances H. Arnold第一個在實驗室環境中成功實施酶的定向進化以改進酶的功能[3]。 Frances H. Arnold報道了枯草桿菌蛋白酶E在高度非天然(變性)環境中的定向進化，即在高濃度的極性有機溶劑二甲基甲酰胺(DMF)中獲得有活性的酶突變體。在DMF存在下進行連續四輪的誘變和篩選后，在60%(體積分數)DMF中產生了比野生型酶高256倍活性的酶變體[3-4]。在她的開創性論文[3]中，阿諾德掌握了酶的定向進化的整個工作流程(圖2)，這是一種依賴于以下幾個步驟的方法：①為所選任務確定合適的起始酶；②構建涵蓋所選序列空間子集的DNA序列文庫；③建立通過優化酶突變體實現功能強化或產生新功能和方法的標準；④通過基因的重排以覆蓋第一輪選擇序列，從而創建新的DNA序列文庫的新子集；⑤設置更嚴格的選擇標準，通過多輪次篩選以達到酶性能的目標水平。多年來，這五個步驟中的每一步都在阿諾德實驗室和其他幾個實驗室中得到了進一步的發展和優化。

圖2 酶定向進化的基本原理[1]Fig.2 The underlying principle for the directed evolution of enzymesAfter a few cycles of directed evolution, an enzyme may be several thousand times more effective.

1)隨機突變是隨機引入基因的，這種酶最終會發生改變；2)這些基因被插入細菌之中，細菌將它們作為模板，隨機性制造突變酶；3)這種改變的酶物質經過測試，篩選出最有效催化所需化學反應的酶。4)新的隨機突變被引入到被篩選出的酶中開始新一輪進化。經過幾個周期的定向進化之后，一種酶的效率可能會提高幾千倍。

此外，Frances H. Arnold 第一次[3]使用易錯(error-prone )PCR來創建和重新分化一個由四個單突變組合形成的DNA序列文庫，通過三輪隨機誘變和篩選，進化枯草桿菌蛋白酶E。選擇標準是乳蛋白酪蛋白的水解。 活性酶突變體在含有酪蛋白的瓊脂平板上產生可見光暈。 因此將細菌菌落分泌的酶轉移到含有DMF和酪蛋白的瓊脂平板上，以便鑒定能夠在有機溶劑存在下活性最高的酶突變體。酶突變體產生比親本酶周圍的暈圈更大的暈圈，從所述酶變體的克隆中分離質粒DNA，并進行進一步的誘變循環?？莶輻U菌蛋白酶E的定向進化，改善了其在極性有機溶劑中的活性是開啟酶的定向進化領域的基準成就。 這項工作成為定向進化方法持續發展的起點。 該領域擴展到可改善和重塑各種新舊化學反應的酶[5-6]， 對有機合成研究以及化學和制藥工業及其他領域的研究具有重要意義。

酶通常具有200～300個氨基酸殘基或更多，不可能隨機突變酶中的每個位置。 事實上，如果靶標是具有完整序列覆蓋的文庫，則只有一小部分氨基酸位置可以變化。 Arnold及其同事已經通過許多實例證明，文庫設計必須基于對分子的洞察和知識的積累來選擇氨基酸變化的位置并且通過易錯PCR隨機的添加元件。

開發和實施定向進化方法的一個突出的早期貢獻者是已故的William P. Stemmer(1957-2013)。 Stemmer為酶的進化引入了一種稱為“DNA重排”的DNA重組策略。這是一種來增加有益突變的有效方法，同時通過隨機片段化和基因重組來增加DNA文庫的大小[7-8]。他指出使用DNA重排，即來自幾種生物的相似基因的DNA重組，可以引入比許多其他方法更多的變異，因此可以提高進化突變體達到預期活性的機會。在原理論證研究中，Stemmer和同事在具有連續更高濃度的抗生素頭孢噻肟的平板上，對β-內酰胺酶(一種負責抗生素抗性的酶) 進行三次DNA重組和篩選，使酶的活性顯著增加[7-8]?；蛑嘏攀窃黾涌贵w多樣性和提高靶標抗體親和力的一種手段，有時稱為親和力成熟，并提供了結合蛋白定向進化的早期實例[9-10]。在這些情況下，重排的基因區段對應于輕鏈[11]或免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的可變環[9-10]。在20世紀90年代后半期，Arnold和Stemmer的實驗室中進一步開發DNA重排，交錯延伸過程(StEP)和其他文庫生成方法，用于 進行酶的定向進化。自20世紀末以來，由于基因從頭合成成本的降低，研究人員可以通過簡并密碼子或完全設計的基因從頭合成來定制多樣性序列文庫。 基因重排和分子設計為進化提供了可用的素材，選擇為定向進化確定方向。

DNA工具自20世紀90年代以來一直在不斷改良，定向進化方法也比從前多了幾倍。弗朗西絲·阿諾德一直走在這些發展的前列。她所在的實驗室制造的酶甚至能夠催化自然界中不存在的化學反應，從而制造出全新的材料。經她“量身定做”的酶已經成為了多種物質的重要生產工具，如藥物生產等。利用這些酶，化學反應速度得以大大提高，副產物也明顯減少，在有些情況下，還能杜絕傳統化學反應中重金屬的使用，因此顯著減小了對環境的影響。

事情總會不斷循環，弗朗西絲·阿諾德如今又開始了對可再生能源生產的研究。她的研究團隊研發了幾種酶，能夠把簡單的糖類轉化成異丁醇。這種物質富含能量，可用于生產生物燃料和環保塑料。他們的長期目標之一是，通過生產更環保的燃料，打造更有利于環境的交通運輸行業。通過應用阿諾德研發的酶制造的其他燃料還可用在小驕車和航天飛機上。由此看來，她研發的酶對更加綠色環保的世界做出了卓越貢獻。

3 噬菌體展示技術

噬菌體展示技術是一項由George P. Smith開發的重大突破技術[12]。 編碼特定蛋白質成員的DNA插入到噬菌體表面蛋白的基因中，以在其表面呈遞蛋白質的方式包裝在噬菌體內。 這簡化了基于與受體結合的篩選， 也簡化了展示最佳結合蛋白的噬菌體的鑒定和擴增。 大腸桿菌噬菌體的感染和在宿主中的增生在每輪選擇后產生富集的文庫。 還可以在選擇輪次之間重新分散噬菌體文庫(圖3)。

George P. Smith在其開創性的論文[12]中證明，多肽可以插入融合噬菌體表面的次要外殼蛋白III中，這種噬菌體展示的多肽保留了與其靶標的相互作用。 在這項工作中，噬菌體展示的多肽是限制性內切核酸酶的57個氨基酸殘基的片段。使用單輪親和純化與內切核酸酶的抗血清，可以將內切核酸酶多肽插入噬菌體表面的外殼蛋白III中表達的噬菌體富集1 000倍。他還預測，使用抗體作為誘餌進行親和純化，可以從噬菌體載體中的隨機插入文庫中分離克隆[12]。在另一篇文章[13]中，Parmley和Smith闡述了他們從1)史密斯在噬菌體外殼蛋白中引入一種基因，之后將噬菌體DNA插入細菌體內；2)從引入基因編碼的肽可作為噬菌體外殼蛋白的一部分展示在噬菌體表面；3)史密斯能夠用已知的抗體將含有特定多肽抗原的噬菌體釣出，從而獲得了多肽的基因。

圖3 噬菌體展示——這是喬治·史密斯開發的一種基于已知蛋白質尋找未知基因的方法[1]Fig.3 Phage display-George Smith developed this method for finding unknowns genes for a known protein

1988年開始，對噬菌體展示技術進行了幾項技術改進，例如，改變展示多肽在蛋白質III中的位置。 這是由于蛋白質III通過與其F菌毛結合而介導大腸桿菌感染， 因此，全功能蛋白III對于噬菌體的繁殖是必需的。Smith使用與生物素化靶標偶聯的鏈霉親和素蛋白包被的培養皿，從較低親和力的背景中親和純化展示高親和力多肽的噬菌體，稱為“生物淘洗”(biopanning)，為親和純化過程中捕獲、洗滌和洗脫展示高親和力多肽的噬菌體提供了簡便的方法。史密斯通過對其靶標進行親和純化，實現了108倍富集展示代表抗β-半乳糖苷酶抗體表位的肽的噬菌體，顯示了其改進方法的可行性。兩篇論文同時發表在同一期Science上[14-15]。 兩個文庫都與外殼蛋白III融合表達。 Devlin及其同事報道了一個包含2 000萬種不同15聚體肽的文庫，用于推斷肽結合基序HPQ，它賦予鏈霉親和素生物素結合位點高親和力[14]。

Scott和Smith報道了一個包含4 000萬個6聚體肽的文庫，用于確定兩種不同單克隆抗體的表位，這些抗體是針對肌紅蛋白的六殘基片段而產生的[15]。 通過連續三輪生物淘洗從文庫中親和純化抗體結合肽，然后感染大腸桿菌以產生用于下一輪的富集噬菌體展示文庫。 經過三輪親和純化，結合對所選克隆的親和力測量，Smith和同事只保留了最高親和力的多肽，可以基于單個克隆的DNA測序推斷抗體表位的共有結合基序[15]。 通過比較大量的氨基酸序列，他們發現表位的前3個氨基酸對于抗體的高親和力結合是最重要的[15]。

4 噬菌體展示抗體

1990年，Gregory P. Winter爵士報告了在絲狀噬菌體上展示折疊且功能完整的抗體片段[16]。 完整IgG是由多于一個氨基酸鏈組成的大的二價分子，因此難以在噬菌體表面上表達。 Winter和同事展示了單鏈可變片段scFv，其中重鏈的可變部分通過柔性多肽接頭與輕鏈共價連接[17]。 因此，scFv攜帶由6個可變環組成的單個抗原結合位點，即所謂的互補限定區(CDR)。Winter概述了抗體噬菌體展示的幾個未來方向和應用[16]。 他提出構建和篩選由重鏈和輕鏈可變結構域的基因的隨機組合產生的抗體文庫，可以在絲狀噬菌體上展示。 他還提出在噬菌體上生產和篩選全合成抗體文庫。Richard Lerner及其同事在1991年報道了抗體片段的噬菌體展示的另一個例子[18]，在這種情況下，沿著噬菌體表面的整個長度，與主要外殼蛋白VIII融合。 這項工作展示了一些較大的抗體片段，即所謂的Fab片段，來源于小鼠抗破傷風毒素，抗體重鏈的兩個結構域顯示在噬菌體上，抗體輕鏈的兩個結構域以分泌形式表達。 來自兩條鏈的片段在噬菌體表面上重建Fab，并且使用生物淘洗實現了超過非特異性噬菌體的2 700倍富集; 研究人員提出，使用連續輪次的生物淘洗會產生更高的富集[18]。

1991年，有研究[9]報告了在絲狀噬菌體上展示的許多抗體文庫。這項工作在幾個實驗室中同時進行，包括Winter和Lerner實驗室。第一份報告描述了scFv抗體片段文庫的噬菌體展示[9]。該文庫來源于用小分子抗原2-苯基惡唑-5-酮(phOx)免疫的小鼠，并展示在絲狀噬菌體的蛋白質III的N-末端。使用固定在柱樹脂上的phOx抗原， 有可能從初始文庫中選擇phOx結合抗體，并且在連續幾輪選擇中高親和力抗體的比例增加。此外，他們發現，如果可變重鏈(VH)和可變輕鏈(VL)基因在親和選擇輪次之間重新組合以產生免疫小鼠中不存在的新組合，則可以得到更高親和力的抗體[9]，包含200 000個scFv序列的原始文庫，但在重新調整VH和VL基因后，這文庫增加到4 000萬個序列，并且回收了更多數量的高親和力phOx結合物。

用于從噬菌體展示文庫中選擇結合肽或蛋白質的標準方法原則上與經典親和純化相同;對靶標具有最高親和力的文庫中的那些個體被捕獲在固體支持物上，然后進行多次和大量的洗滌步驟，然后用酸洗脫最佳結合肽及其連接的噬菌體，中和并用于感染大腸桿菌以產生豐富的文庫。因此，富集的文庫中包含許多高親和力多肽的拷貝，而較低親和力多肽的拷貝數很低。整個實驗重復幾次，并通過降低所用靶標的量連續增加選擇的嚴格性，獲得更高親和力的多肽。噬菌體展示的多肽和蛋白質的選擇通常使用固定在色譜樹脂、培養皿、磁珠或其他支持物上的靶標進行。然而，在細胞展示的情況下，更常見的是使用流式細胞術，這種結合可以和熒光讀數耦合。通過仔細選擇孵育和洗滌時間，可以將選擇策略基于目標和文庫成員之間的關聯或解離速率，而不是基于親和力。 通過調用某種選擇壓力，如升高的溫度或蛋白酶的存在，噬菌體展示可用于提高蛋白質穩定性(圖4)。

格雷戈里·溫特和同事們創立了一家基于抗體噬菌體展示技術的公司。在1990年代，這家公司開發出一種新藥，其完全基于一種人類抗體：“阿達木單抗”(adalimumab)。這種抗體能夠中和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，這種蛋白質在許多自身免疫疾病中引發炎性反應。在2002年，這種藥物被批準用于類風濕性關節炎，而現在這種藥物更是被應用于不同類型的牛皮癬以及炎性腸道疾病的治療?！鞍⑦_木單抗”的成功在制藥行業掀起波瀾，噬菌體展示技術被很快應用于生產癌癥抗體和其他藥物，其中有一種藥物能夠釋放人體自然殺傷細胞，以便后者去對腫瘤細胞發起攻擊。腫瘤細胞的生長將被遲滯，甚至在某些案例中，成功治愈了患有轉移性腫瘤的患者，這在腫瘤治療史上是一項重要的成就。另一種已經被批準的抗體藥物則可以被用于中和引發炭疽的細菌性毒素，還有一種藥物可以緩解某些自身免疫疾病，如狼瘡，還有更多的類似藥物正處于臨床實驗階段，其中包括對抗阿爾茨海默癥的藥物。

5 應用前景

酶的定向進化已成為生物催化劑開發的高效方案，具有高特異性，有限的副反應和對不同反應條件的耐受性。 定向進化是一種通用且有效的途徑，可以生產具有新功能的酶和功能優化的酶。 從定向進化研究中得出的一個主要結論是酶確實可以被調節以催化新反應，并且反應與自然界自身酶催化的反應非常不同。 在反應性、底物特異性和化學反應以及對各種反應條件的耐受性方面，存在充分的空間用于酶功能的優化和重定向。 我們可能與酶催化反應的極限相距甚遠——還有很大空間進一步發展。

結合蛋白的定向進化已成為用于開發治療性抗體的高效方案。多肽和抗體的噬菌體展示用于衍生對給定靶標具有高親和力的突變體，并提供關于結合反應、蛋白質折疊和穩定性的親和力和特異性的序列要求和分子驅動力的有價值信息。在過去的25年中，已經使用定向進化以改善結合親和力，同時保留抗體的高選擇性。這種“親和力成熟”方法得到的抗體在1012～1015M-1范圍內對其抗原具有親和力，相對于免疫產生的抗體， 從噬菌體展示文庫中提出的抗體親和力提高了數千至數百萬倍。這種非常高的親和力使得它們可以用作皮下自給藥治療劑，而不需要在醫生辦公室中在靜脈內注射更大量的治療劑。目前，科研人員已經使用噬菌體展示技術鑒定一系列人抗體，并且在臨床上用于炎性疾病和癌癥的治療。

圖4 利用噬菌體展示技術進行抗體定向進化的原理，該方法可以用于生產新的藥物[1]Fig.4 The principle for the directed evolution of antibodies using phage display，This method was used to produce new pharmaceuticals

1)抗體結合位點的遺傳信息被插入到噬菌體DNA之中。此后可用于創建一個具有多樣性的抗體庫；2)通過靶抗原篩選出對特定抗原具有強附著性的噬菌體；3)在進行另一輪選擇之前，將隨機突變引入附著在目標抗體的噬菌體上；4)隨著新一代抗體的出現，抗體會更特異地、更加強烈地附著在目標蛋白質上。

2018年諾貝爾化學獎獲獎人所引入的方法已經在全球廣泛應用，它讓化學工業變得更加綠色環保，幫助產生新的物質，生產數量可觀的生物燃料，消除疾病，拯救生命。酶的定向進化以及抗體的噬菌體展示技術，讓今年的3位獲獎人——弗朗西絲·阿諾德、喬治·史密斯以及格雷戈里·溫特爵士得以幫助人類社會創造最大福祉，并為化學領域的一場深刻革命奠定了基礎。