非典型蛋白激酶表達與胰腺癌相關性的研究

程明，梁怡明，鄔林泉

(1、江西省九江學院附屬醫院肝膽外科，九江 332000；2、南昌大學第二附屬醫院肝膽外科，南昌 330000)

胰腺癌在目前已知的惡性腫瘤中，惡性程度很高，預后極差，5年生存率不到1%，其中胰腺導管腺癌占90%以上，是一種診斷和治療都很困難的消化道惡性腫瘤，其發病率和死亡率呈逐年上升趨勢，新世紀以來，其上升趨勢更加明顯，在我國人口死亡的十大惡性腫瘤中排第7位，每年的死亡率幾乎相當于當年的新發病率。由于胰腺位置深在，無典型臨床特征，早期確診率很低，易轉移，手術并發癥多，操作困難，手術死亡率高，無特效化療方案，易產生化療耐藥性等，基于以上特點，胰腺癌是惡性程度最高的實體腫瘤之一[1]。胰腺癌的診斷、治療是目前醫學界公認的難題，目前胰腺癌的診斷主要依靠各種影像學檢查 （彩超、CT、磁共振等），配合血清腫瘤標志物等實驗室檢查。但影像學檢查往往受限于設備及醫師的診斷經驗，對于早期胰腺癌、轉移灶和血管侵犯的準確診斷率較低，而且目前的腫瘤標志物特異性不高，導致相當大部分病人失去手術的最佳時機[2]。因此在改進影像學檢查設備及技術的同時，能夠給找到一種或幾種具特異性腫瘤標志物，對提高胰腺癌的早期診斷率和判斷臨床預后有重要意義[3，4]。蛋白激酶C家族 （PKC）在多種癌癥中均有重要作用，PKC 家族包括典型蛋白激酶 cPKCs[α（α）、βI（βI），βII（βII），和 γ（γ）]、nPKCs[delta（δ），epsilon（ε），eta（η）和 theta（θ）]以及非典型蛋白激酶[zeta（ζ）和iota（ι）]，PKC 家族在腫瘤的發生、發展、轉移和凋亡過程中發揮重要作用，部分PKC高表達，部分PKC低表達。國內外大量研究表明PKCι在非小細胞肺癌、結腸癌、卵巢癌中均有高表達，其中國外有研究表明PKCι在胰腺癌中高表達，但國內尚未見相關報道[5]。本實驗采用免疫組織化學的方法測定PKCι在胰腺癌及癌旁組織中的表達情況，證實PKCι在胰腺癌組織中陽性表達率較高，為盡可能早期診斷胰腺癌、了解胰腺癌的發生、發展規律、判斷臨床治療預后提供依據，為提高胰腺癌的綜合治療效果提供新的方法。

1 資料與方法

1.1 標本收集 標本取自南昌大學第二附屬醫院2014年1月至2016年2月間30例胰腺癌組織和此30胰腺癌癌旁組織（距腫瘤均在3cm以上），經病理檢查證實均為胰腺導管腺癌且臨床資料完整，男 19例，女 11例；年齡 42～68歲，平均 51.2歲。按美國癌癥聯合會AJCC分期（第8版），T1期4例、T2期 6例，T3期 20例、T4期 0例；按照病理分級，高分化21例，中、低分化9例。兩組患者術前均未接受任何手術治療及放、化療。

1.2 試劑 非典型蛋白激酶ι（PKC-iota）兔抗人單克隆抗體購于上海安妍生物技術公司。ABC試劑盒及DAB-HCL顯色試劑盒，購自武漢博德公司，染色步驟按免疫組化（三步法）進行，一抗稀釋度為 1∶100。 檸檬酸抗原修復液(0.01M，pH6.0)、磷酸鹽緩沖液(0.01M，pH7.2～7.4)、緩沖液、5%脫脂奶粉等為自行配制，組織裂解液、SDS-聚丙烯胺凝膠、NC膜購自北京賽坦因生物科技有限公司。

1.3 PKCι測定方法與結果判定

1.3.1 免疫組織化學法 兩組各30例標本均按病理切片方法行4%多聚甲醛固定、常規石蠟包埋后切片機將標本切4μm薄片，按常規方法行伊紅染色和免疫組織化學法染色。陽性表達以胞核中呈現黃色至棕色顆粒為特征，評分標準為免疫反應分數。染色強度標準：不著色為0分，淡黃色1分，黃色2分，棕黃色3分；陽性細胞百分比：≤5%為0分，6%～25%為 1分，26%～50%為 2分，51%-75%為3分，＞75%為4分。 免疫反應分數(immunoreactivescore，IRS)等于兩分值相乘，標準如下：0 陰性，1-4 弱陽性(+)，5～8 中等陽性(++)，9-12強陽性(+++)，陰性表達為陰性及弱陽性，陽性表達為中等陽性與強陽性。

1.3.2 蛋白印跡法蛋白印跡法 取胰腺癌標本30份，癌旁組織標本30份；各取2g加至已預冷的緩沖液中，剪碎后在0℃以下冰水中行冰水浴后再行超聲粉碎，高速離心器中保持4℃恒溫行高速離心，沉淀后取其上清液即細胞漿蛋白，將提取細胞漿蛋白后剩下的沉淀物用1ml胞膜蛋白提取液懸浮，超聲粉碎后放置并提取1h，再于高速離心器中保持4℃恒溫行高速離心1h，待沉淀后取其上清即為胞膜蛋白。將上述提取出的胞漿、胞膜蛋白進行蛋白定量，兩組提取物調定至等蛋白濃度備用。在Western-blot垂直電泳儀中行SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳30min，然后進行電轉印，蛋白質經電泳后轉移到NC膜上；分別加一抗及二抗后使用DABHCL顯色試劑盒進行DAB顯色反應。顯色的NC膜經UVP照相系統掃描成像，計算成像后曲線下面積可以得到定量凈光密度數據。

1.4 統計學分析 使用SPSS 19.0統計軟件包對所得各組實驗數據進行分析。各組間率的比較采用χ2檢驗進行統計學處理，定P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PKCι在胰腺癌組織和癌旁組織中的表達

2.1.1 免疫組織化學法 PKCι在胰腺導管腺癌組織中的表達主要定位于細胞核中（圖1），其陽性率為 80%（24/30）；癌旁組織為 20%（6/30），差異具有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 、圖2 胰腺癌組織(1A、1B)和癌旁組織(2C、2D)中PKCι的染色（圖中細胞核棕色為陽性）。

2.1.2 蛋白印跡法 胰腺癌組織細胞核中PKCι表達高于胰腺癌細胞膜、癌旁組織細胞核及癌旁組織細胞膜。

PKCι在胰腺癌與癌旁組織胞核、胞膜中的表達明顯不同。胰腺癌組織胞核PKCι的表達明顯高于癌旁組織胞核，其P＜0.05，差異有統計學意義。胰腺癌組織胞膜中PKCι則與癌旁組織胞膜、癌旁組織胞核無明顯區別，其P＞0.05，差異無統計學意義，說明PKCι主要存在于胰腺癌組織胞核中。

圖3 PKCι在各組織的WB圖

圖4 PKCι在胰腺癌與癌旁組織胞核、胞膜中的表達。

表1 PKCι在胰腺癌組織細胞核、胰腺癌組織細胞膜、癌旁組織細胞核、癌旁組織細胞膜的光密度值表

2.2 PKCι的表達與腫瘤分期、淋巴結轉移、遠處轉移呈正相關，而與患者的年齡、性別均無明顯相關性。

表2 胰腺癌組織PKCι表達與胰腺癌臨床病理參數間的關系

3 討論

蛋白激酶PKC家族于1977年被日本科學家Nishzuka首先發現，PKC家族是一組結構相近的絲/蘇氨酸蛋白激酶，其中包含有多種同工酶，動物體內多種組織均可檢測到其活性，蛋白激酶C（PKC）同工酶在許多細胞功能中發揮重要的調控作用，包括增殖控制、腫瘤的非控制生長和人類癌細胞的存活。近年來已經有大量前瞻性研究表明，多種人類腫瘤組織中均可見到PKC家族活性表達異常[6-9]。對PKC家族及其抑制物的研究對于揭示腫瘤的發生發展機制及提高腫瘤的防治率均有重大意義。PKC酶家族分為3組：傳統的鈣依賴cPKCs[α（α）、βI（βI），βII（βII），和 γ（γ）]；新發現的非 鈣 依 賴 nPKCs[delta（δ），epsilon（ε），eta（η）和theta（θ）]；非典型蛋白激酶[zeta（ζ）和 iota（ι）]。 然而經過詳細的研究，到目前為止，只有一個PKC同工酶，即非典型PKC-iota(PKCι），已被證明能滿足人類致癌基因的標準[10-12]。有研究表明，PKCι的過度表達，在非小細胞肺癌（NSCLC）、卵巢癌和結腸癌的腫瘤生長中起著至關重要的作用。在肺鱗狀細胞癌與卵巢漿液性癌，PKCι表達往往是腫瘤特異性prkci基因擴增的結果。有文獻表明，很多癌基因 例 如 V-SiS，Verb，r-ras，PKC-α 等 都 可 激 活PKCι發揮其致癌作用，這個激活過程是個不斷增強的正反饋反應，即各種致癌物質可以直接或通過激活癌基因間接激活PKCι，被激活后的PKCι又可激活基因來源相同的同源癌基因，同時已活化的PKCι向正常組織細胞核內轉移，從而將致癌基因的遺傳密碼引入細胞核內，使致癌基因表達相應蛋白產物，該已表達的產物又可反向激活PKCι，整個致癌過程循環往復，使癌癥基因信息以正反饋形式不斷地在體內加強、擴大，最終導致正常細胞增殖不受控制，致使組織癌變[13，14]。本研究表明PKCι在胰腺癌組織中存在陽性表達，其與腫瘤分期、淋巴結轉移、遠處轉移呈正相關，而與患者的年齡、性別均無明顯相關性。據相關文獻報道，胰腺導管腺癌占胰腺癌90%以上，本次實驗標本均為導管腺癌，至于其他類型胰腺癌中PKCι表達情況暫無標本進行研究。本研究為了解胰腺癌的發生、發展機制提供了新的線索。在不遠的將來我們使用PKCι抑制劑如金硫代蘋果酸鹽（ATM）靶向治療胰腺癌[15-17]，從而有可能為我們治療胰腺癌找到一條新的思路，大大提高胰腺癌的治療效果。