SLE患者血清CXCL13水平與腎臟受累的相關性研究＊

何德寧，胡建康，朱靜茹，戴森華，柳毓文，胡娜

(江西省萍鄉市人民醫院風濕免疫科，萍鄉 337000)

系統性紅斑狼瘡（SLE）是一種多系統受累、多種自身抗體分泌的自身免疫性疾病。SLE病因未完全明確，通過對動物模型及狼瘡患者研究發現，B細胞異常在SLE發生發展過程中發揮著重要作用。B細胞是免疫系統重要組成部分，不僅是抗體分泌前體細胞，而且具有抗原遞呈、免疫調節等功能。B細胞生物靶向治療在難治性狼瘡取得一定療效，使得人們越來越重視B細胞在SLE中的作用[1，2]。CXCL13是屬于趨化因子家族中一個小的細胞因子，通過與其受體CXCR5結合調節不同類型白細胞的運輸。由于它具有吸引B細胞的能力，又被稱為B淋巴細胞趨化因子（BLC）。CXCL13可以選擇性作用于不同亞群B淋巴細胞，是最有力的B細胞趨化因子之一。已有研究發現[3]，類風濕關節炎患者關節滑膜異位淋巴濾泡組織中CXCL13異常表達，病情控制后CXCL13下降，并且CXCL13與DAS28評分呈正相關。在NZB/W-F1狼瘡模型小鼠中[4]，CXCL13是狼瘡腎炎發生過程中極其重要的一種細胞因子。為此，我們通過對LN患者血清CXCL13研究，并觀察不同分類LN患者CXCL13變化，進一步探討SLE發病機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 所有入選SLE患者均符合1997年美國風濕病學會 （ACR）修訂的SLE分類標準11項中的4項或以上，年齡小于70歲，無乙肝相關性腎炎，無并發感染或/和腫瘤，無嚴重心肺功能不全。LN診斷應滿足下列條件之一：⑴ANA陽性并腎活檢病理有LN典型特征；⑵確診SLE患者，并滿足下列條件之一：24h尿蛋白大于0.5g；或3+；或尿紅細胞數大于5個/高倍鏡視野、尿白細胞數大于5個/高倍鏡視野并且排除由于尿路感染引起；或管型（紅細胞、血紅蛋白、顆粒或混合管型）。所有入選LN病例均進行腎穿刺行常規病理檢查并免疫組化法檢測CD3、CD20、CD21表達。入組情況：LN患者89例，無腎臟受累SLE患者25例，健康對照者11例。各組間年齡、性別比無差異。記錄受試者詳細臨床資料。

1.2 主要試劑和儀器 CXCL13試劑盒購于美國R&D 公司。 CD3 抗體：clone PS1，Novacastra；CD20抗 體 ：clone L26，DAKO 公 司 ；CD21 抗 體 ：clone 2G9，基因公司。免疫組化檢測試劑盒：DAKO EnVision plus。經皮自動活檢槍：德國BARD公司MN1616。

1.3 實驗方法

1.3.1 血清CXCL13濃度測定 抽取受試者早晨空腹血2ml，3000r/min離心5min，血清分裝后于-80℃冰箱保存備用。CXCL13檢測采用ELISA法，具體操作同試劑盒說明書。

1.3.2 腎組織CD3、CD20、CD21表達 腎臟穿刺活檢方法采用B超引導下，定位右腎下極，經皮自動活檢槍穿刺，獲得1.5-2厘米長度腎組織3條。所有入選的腎組織標本用10%福爾馬林固定，石蠟包埋切片，切片厚3-4μm，常規行蘇木素伊紅（HE）染色、過碘酸-schiff（PAS）、六胺銀（PASMMasson）染色、馬松三色（Masson-Trichrome）染色。以 CD20 （1：800） 作為 B 細胞表面標記、CD3（1：100）作為T細胞表面標記、CD21作為濾泡樹突狀細胞（FDC）的表面標記，在病理石蠟連續切片上進行染色。用扁桃體組織作陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。

1.4 統計學處理 SPSS 17.0統計軟件分析。數據以中位數（四分位數）表示，兩組間比較采用Mann-Whiney或Wilcoxon檢驗，多組間比較采用方差分析，兩兩相關性分析采用Spearman法，P＜0.05認為有統計學意義。

2 結果

2.1 SLE患者血清CXCL13異常表達 根據有無腎臟受累，將 SLE 患者（n=114）分為 LN 組（n=89）及無腎臟受累SLE組（n=25）。SLE患者血清CXCL13水平[230.65(145.92-365.40)pg/ml]明顯高于健康對照者[85.13(62.23-131.58)pg/ml](Z=4.42，P＜0.001)。并且，LN患者CXCL13水平 [258.86(185.50-392.18)pg/ml]高于無腎臟受累SLE患者 [136.39(104.23-257.50)pg/ml](Z=2.53，P=0.01)。

2.2 CXCL13與SLE病情相關性 SLE患者血清CXCL13水平與 SLEDAI呈正相關 (r=0.55，P＜0.001)，與補體 C3 呈負相關(r=-0.39，P＜0.001)，而與抗ds-DNA抗體滴度無明顯相關 （r=0.037，P=0.72）。

2.3 不同分類LN患者CXCL13表達

2.3.1 WTO病理分類LN患者CXCL13表達變化入選89例LN患者中，Ⅲ型21例，Ⅳ型53例，V型15例，無Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ病例。Ⅲ型和Ⅳ型LN患者血清CXCL13水平均較V型LN患者升高（Ⅲ型287.58(198.25-355.44)pg/ml，Ⅳ型 271.96(189.71-434.99)pg/ml，V 型 169.71(101.09-252.69)pg/ml；Ⅲ型 vs V 型，P=0.013；Ⅳ型 vs V 型，P=0.002），而Ⅲ型和Ⅳ型LN患者血清CXCL13水平表達無差異 （P=0.39）。

2.3.2 免疫組化分類LN患者CXCL13表達變化

2.3.2.1 根據腎組織有無CD20細胞表達將病例分為B細胞組（69例）和無B細胞組（20例）。B細胞組血清CXCL13水平[287.57(196.37-416.71)pg/ml]高于無B細胞組[200.13(139.07-239.81)pg/ml](Z=2.844，P=0.004)。

2.3.2.2 根據CD20+細胞、CD3+細胞和CD21+細胞共表達模式差異，將病例分為四類[5]：0類：CD20+細胞無表達，或僅有CD3+細胞表達，無CD21+細胞表達；1類：CD20+細胞表達，和/或CD3+細胞表達，若同時有CD3+及CD20+細胞表達兩者呈散在分布，無 CD21+細胞表達；2類：CD20+細胞及CD3+細胞均有表達且兩者呈區域分布，無CD21+細胞表達，形成非典型ELT；3類：CD20+細胞及CD3+細胞均有表達呈區域分布，同時有CD21+細胞表達，形成典型ELT。本研究中，0類病例20例，1類18例，2類51例，未發現3類LN病例。2類患者血清CXCL13水平較0類和1類患者均顯著升高（0 類 180.96(101.93-218.88)pg/ml，1 類 216.91(158.47-327.15)pg/ml，2 類 351.80(251.13-470.36)pg/ml；2 類 vs 0 類：Z=4.79，P＜0.001；2 類 vs 1 類：Z=2.32，P=0.02）。同時，1 類患者血清 CXCL13 水平較 0 類患者升高（Z=2.13，P=0.033）。

表1 不同病理類型LN腎組織ELT形成模式

2.4 LN患者治療前后CXCL13變化 我們隨訪10例初診LN患者，予激素、免疫抑制劑治療。治療6月后血清CXCL13及SLEDAI均較治療前明顯下降[CXCL13：321.45(197.52-428.02)pg/ml vs 195.54(165.98-233.01)pg/ml，Z=-2.59，P=0.009；SLEDAI：10(8.75-12)vs 6(4-6.5)，Z=-2.56，P=0.01]。

3 討論

趨化因子是一組小分子質量蛋白質的集合，分子量多為8-11KDa，其在B、T淋巴細胞遷移和聚集并參與炎癥反應過程中發揮了重要作用。CXCL13主要由次級淋巴組織、淋巴結和濾泡中的樹突狀細胞分泌，其異常表達可以促進炎癥細胞聚集，引起非淋巴器官形成含有生發中心的異位淋巴樣組織（ETL）。其受體CXCR5主要分布于次級淋巴器官中的成熟B細胞和部分T輔助記憶細胞。CXCL13與CXCR5共同作用引導成熟B細胞游走及歸巢過程。CXCL13在SLE發病機制中的作用受到廣泛關注。國內研究報道[6]，SLE患者血漿CXCL13表達水平明顯高于健康對照者，有靶器官（腎臟、中樞神經系統）受累的SLE患者血漿CXCL13水平較無器官受累的SLE患者明顯升高，并且CXCL13與SLE疾病活動指數呈正相關。國外研究也有類似報道[7，8]，并且發現SLE患者血清CXCL13水平與補體C3呈負相關，與抗ds-DNA抗體滴度呈正相關。與大部分研究結果相似，我們發現LN患者血清CXCL13水平明顯高于無腎臟受累SLE患者和健康對照者。血清CXCL13水平與狼瘡活動度SLEDAI呈正相關，與補體C3呈負相關，但與抗ds-DNA抗體滴度無相關。研究結果提示我們，CXCL13可能參與SLE靶器官受累。

腎臟是SLE最常累及的靶向器官，對LN患者CXCL13的研究可進一步了解紅斑狼瘡器官損害過程。通過對狼瘡模型小鼠研究發現[9]，CXCL13過度表達可以誘導非淋巴器官異位淋巴組織形成并通過炎癥細胞在腎組織聚集導致疾病惡化。MRL/lpr小鼠接受CXCL13抗體治療6周后尿蛋白、血肌酐下降，腎臟病理損傷減輕[10]。有研究報道[11]，LN患者腎穿刺組織中，B細胞浸潤組織CXCL13蛋白及mRNA表達明顯增加。研究還發現，受累器官中有B細胞浸潤的患者愈后相對更差。為進一步了解CXCL13與腎組織B細胞浸潤關系，我們檢測LN患者血清CXCL13并同時觀察穿刺腎組織B細胞浸潤情況。研究發現，LN患者腎組織B細胞浸潤率高達76.4%，有B細胞浸潤LN患者血清CXCL13水平較無B細胞浸潤患者明顯升高。不同病理類型LN患者CXCL13水平也存在差異，Ⅲ、Ⅳ型LN患者血清CXCL13表達異常升高。由于研究條件限制，本研究未能納進Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ型LN患者。研究還發現，血清CXCL13與LN患者腎臟B細胞浸潤模式相關。血清CXCL13水平越高，腎組織B、T淋巴細胞浸潤越明顯并越可能形成ETL；而CXCL13越低，腎組織中B細胞浸潤減少。經激素、免疫抑制劑有效治療后隨著疾病的控制CXCL13水平亦下降。上述研究結果提示我們，CXCL13在SLE病程中腎臟受累發揮了重要作用，它可能參與B細胞游走及歸巢過程，誘導B細胞在靶器官中異常聚集并形成ETL。同時，CXCL13水平升高明顯的SLE/LN患者，更需要積極的、長期的治療。

CXCL13在室溫中可穩定表達至少24h，經過多次凍融后水平仍穩定，為其廣泛用于臨床檢測提供了良好條件[12]。綜上所述，CXCL13可能成為評判SLE疾病活動的有效指標，對SLE病情嚴重程度、腎臟累及情況及愈后的判斷有一定的應用價值，也為SLE治療學研究提供新的思路和靶點。