體內外受精及玻璃化冷凍對小鼠胚胎體外發育的影響

鄧星，段超群，黎興盛，袁照清，李清，劉珍，韓艷

(江西省宜春市婦幼保健院輔助生殖科，宜春 336000)

自1978年世界上首例“試管嬰兒”路易斯.布朗在英國誕生以來，人類輔助生殖技術(assisted reproductive technology，ART)發展迅速，迄今為止，全世界已經有大約500萬例試管嬰兒出生[1]。人類ART的成功依賴臨床和胚胎實驗室的緊密配合，其中實驗室質量控制的好壞直接影響到配子的結合和受精卵的發育，進而影響到體外受精-胚胎移植（in-vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)的成功率[2]，我國人類體外受精胚胎移植實驗室操作專家共識（2016版）規定新裝修胚胎培養室啟用前需要用鼠胚試驗(mouse embryo assay，MEA)，要求囊胚形成率在75%-80%為合格[3]，鼠胚試驗合格后才能投入使用。此外，玻璃化冷凍技術因其簡單快速有效，并且在復蘇率和囊胚孵出率等方面均優于傳統程序冷凍技術而被廣泛應用。玻璃化冷凍技術提高了每次促排卵/取卵周期的累計妊娠率[4]。本研究擬分別對體內、體外完成受精過程的昆明小白鼠受精卵體外培養至第5d，觀察其卵裂率、囊胚率；并對囊胚進行玻璃化冷凍及繼續培養，比較囊胚冷凍與否孵出率的差異，以對我院新建胚胎培養室的環境和培養體系進行檢測，為本單位順利開展人類胚胎體外培養提供可靠的實驗依據和質量控制保證。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇湖南斯萊克景達實驗動物公司的6-8周齡昆明白雌鼠；選擇年齡盡可能大的雄鼠(10周)。光照制度：或者12h黑暗，12h光照。室內溫度為20-26℃。雄鼠單籠飼養，雌鼠集中飼養，保證飼養密度不低于100cm2/只，自由飲水采食，飼料為小鼠繁殖料。PMSG（由杭州動物藥品廠提供）500IU/支（使用特定稀釋液將PMSG稀釋成100IU/ml）、人絨毛膜促性腺激素（HCG）500IU/支（使用注射用水將HCG稀釋成100IU/ml）、Vitrolife序貫培養液（瑞典）、、冷凍解凍液（VT101，VT102），載桿購自日本加藤公司。

1.2 方法

1.2.1 受精卵的獲取 體內受精卵的獲取：分批次(3只為一批次)對健康的雌性小鼠在統一的時間(17：00)進行腹腔PMSG10IU(0.1ml)注射；注射48h后進行HCG 10lU(0.1ml)注射。然后按照雄鼠：雌鼠1：1的比例將雌雄小鼠合籠，若隔日晨見陰道栓則交配成功。隨后處死雌鼠，取出輸卵管，在體顯微鏡下取出受精卵，對獲取的受精卵洗滌并脫顆粒細胞后將每個微滴放10個受精卵置于卵裂培養皿中，6%CO2培養箱中培養。體外受精卵的獲取：分批次采用上述體內受精所述的方法注射雌鼠，HCG注射后隔日早8：30處死雌鼠，同上述的方法處理輸卵管，通過輕輕擠壓方式獲得卵冠丘復合物，對獲取的卵冠丘復合物進行洗滌后置于受精皿中，每個微滴放10個受精卵將其放置到培養箱中。隨后，采集雄鼠的附睪尾精液利用微滴受精法進行體外受精。

1.2.2 囊胚的玻璃化冷凍復蘇 冷凍：胚胎置于平衡液中5-15min（不可超過15min），此過程內可見細胞皺縮后重新擴張。將胚胎轉入冷凍液，至少于3個不同液滴多次吸放胚胎，以便充分清洗除去平衡液。將胚胎轉到冷凍載桿上，每管1-3枚胚胎。盡量減少殘留冷凍液的體積，約1-2μl為佳。迅速將載桿浸入液氮中。注意胚胎與冷凍液接觸時間不可超過1min。復蘇：將冷凍載桿插入復蘇1液中，可見胚胎從載桿脫落至復蘇1液。胚胎于復蘇1液中停留1min，依次轉至復蘇2液3min及復蘇3液5min，最后于復蘇4液中平衡5min，轉入培養液，于培養箱內培養12h記錄囊胚孵出情況。

1.3 觀察指標 本次實驗中觀察的指標包括：卵裂率、囊胚率、囊胚孵出率。根據Gardner[5]等綜合囊胚擴張狀態，內細胞團和滋養層細胞的發育對囊胚的質量進行全面評定。囊胚評分4期，內細胞團及滋養層為B級以上的胚胎用于本實驗研究。

1.4 統計學方法 本次研究采用了SPSS 21.0進行分析，計數資料用百分比表示，采用χ2檢驗，P＜0.05，差異有統計學意義。

2 結果

2.1 比較體內、外受精小鼠胚胎的體外發育情況體內受精昆明白小鼠共進行了9個批次試驗，結果見表1。體外受精昆明白小鼠共進行了8個批次試驗，結果見表2。

體內、體外受精獲得的卵裂率和囊胚形成率經卡方檢驗，P值均大于0.05，即2-細胞率和囊胚形成率在體內受精組與體外受精組間差異無統計學意義(P＞0.05)。

2.2 比較新鮮囊胚與冷凍囊胚的孵出率 玻璃化冷凍組與未冷凍組的囊胚孵出率差別并無統計學意義（P＞0.05）。 實驗結果見表 3。

表1 昆明白小鼠體內受精胚胎體外發育

表2 昆明白小鼠體外受精胚胎體外發育情況

表3 囊胚冷凍與否的孵出率

3 討論

胚胎實驗室是人類輔助生殖技術順利實施的重要部分，是保證ART成功的重要核心條件。質量控制在體外受精及胚胎培養的過程中有著至關重要的作用。而囊胚培養及玻璃化冷凍技術也是現代輔助生殖技木不可缺少的部分。文獻報道，體外延長培養能有效篩選具有發育潛力的胚胎，優質囊胚形成與D2、D3胚胎的卵裂球數及碎片評級密切相關[6]。鼠胚實驗分析(MEA)適用于新建的IVF實驗室質控[7]。

體內受精法采集2-細胞胚胎，該方法雖穩定簡單，但其不能良好地評價配子及受精卵對培養所用的試劑耗材的敏感性，不能對體外受精的全過程和實驗操作人員進行全面評價及發現培養體系中存在的問題[8]。受精在輔助生殖技術中是極為重要的，是精子和卵子相互作用的結果[9]。且已有的研究結果顯示1-細胞鼠胚胎比2-細胞鼠胚胎對胚胎發育的影響更敏感，更有利于檢測出不利因素對胚胎發育的影響[10]。所以，我們將兩種方法結合，對胚胎實驗室進行了全面的質量控制，得到了較好的結果，體內外受精體外胚胎培養2細胞率，囊胚形成率差別并無統計學意義（P＞0.05），符合IVF-ET實驗室的質控標準[11]。

近年來，在輔助生殖領域中玻璃化冷凍技術廣泛應用于胚胎及卵母細胞[12]。該技術以其簡便、高效等優勢逐漸代替傳統程序化冷凍，大量研究證實玻璃化冷凍技術能夠高效地保存人類胚胎[13，14]。我們的實驗結果表明，玻璃化冷凍囊胚復蘇后的孵出率與未冷凍的囊胚孵出率的差別并無統計學意義（P＞0.05），一方面可以說明我們實驗室的玻璃化冷凍技術并未對胚胎孵出造成不利的影響；另一方面說明本實驗室的培養環境適合胚胎發育，同時也可以證明實驗室的質量控制和技術員的操作水平達到了實施IVF實驗室的要求。

我們實驗使用小鼠體內受精和體外受精這兩種方法獲得受精胚，進行胚胎培養發育到囊胚以及對囊胚進行玻璃化冷凍，作為實驗室培養體系監測評價指標，為完成人類輔助生殖技術的安全有效的實施提供保障。