吳 鵬,任云霞*,張坤生,陳金玉
(天津商業大學生物技術與食品科學學院,天津市食品生物技術重點實驗室,天津 300134)
蝦蛄(Oratosquilla oratoria)又稱皮皮蝦,其肉中含有大量水分,味道鮮美,誘人可口[1]。同時蝦蛄也是一種營養價值極高的水產品,蛋白質及維生素含量較高,其中蛋白質含量高達20%,營養成分全面,組成合理,有利于人體消化吸收。但蝦蛄具有季節性強及不易保鮮的特點,因此,為使營養價值更加全面地被開發和利用,將其制成成品或半成品是一大研究熱點[2]。蝦蛄肉中的肌原纖維蛋白(myofibril protein,MP)約占總蛋白含量的50%~55%,MP是一種鹽溶性結構蛋白群,對于肌肉的嫩度、收縮性有很大影響,同時還會影響肉品的黏著性、保水性及彈性等流變學特性,在生物學上具有很重要的功能特性[3]。因此,通過研究蝦蛄肉中的MP可以為蝦蛄制品的產業化發展提供理論基礎和技術支撐。添加外源輔料可以加強并改善食品中蛋白質的各種功能特性,從而提高食品的營養價值并延長其貨架期,促進行業的發展,因此是目前國際上的一大研究熱點。楊 明[4]、 王 有 基[5]、 Luo Yongkang[6]、 趙 春 青[7]、Voutsinas[8]、Elizalde[9]等將馬鈴薯淀粉和轉谷氨酰胺酶等其他外源添加物添加到魚肉和豬肉等MP中,研究結果表明,這些外源添加物均可以提高MP的功能特性。
蛋白質磷酸化是一種最普遍、也是最重要的控制和調節蛋白質功能和活力的修飾手段。田少君[10]、李陽陽[11]等分別采用三氯氧磷和多聚磷酸鈉對大豆分離蛋白進行磷酸化,發現磷酸化修飾顯著改善了蛋白質的乳化、理化以及凝膠性質。王詩萌等[12]通過向蝦蛄磷酸化MP中添加魔芋膠、黃原膠和卡拉膠,得出3 種食用膠均能提高蛋白質的凝膠保水性。
海藻糖是一種由1,1-糖苷鍵構成的非還原性天然糖類,大量體內含有海藻糖的生物,當其處在高滲透壓、過冷、過熱或干燥失水等條件下時,海藻糖會在細胞表面形成一種非常獨有的保護膜,它能有效保護蛋白質分子結構,使其不變性失活,從而維持生命體的正常代謝過程,因此海藻糖對多種生物活性物質均具有很強的保護作用[13]。自然界中很多物種體內均含有海藻糖,它們通常在較惡劣的環境中都具有很強的抗逆耐受力,這也證明了海藻糖的優良保護特性,它可以作為維持食品風味、防止劣化、提升品質的獨特配料,在食品工業中的應用范圍很廣[14]。
目前,國內外關于MP磷酸化的報道并不多,關于海藻糖這種優良的海鮮低溫保護劑對蝦蛄磷酸化MP功能特性的影響更是鮮有研究,希望通過本研究可以促進海藻糖在蝦蛄中的應用,為有效改善蝦蛄制品的生產及延長貨架期提供理論支持。本研究探究添加不同質量濃度的海藻糖對蝦蛄磷酸化MP表面疏水性、濁度、乳化性質、起泡性和泡沫穩定性、熱穩定性以及凝膠特性的影響,以期為蝦蛄肉制品的產業化生產提供理論依據和技術支持,促進食品行業的發展。
蝦蛄購于天津市西青區王頂堤水產批發市場,凍藏于-80 ℃超低溫冰箱中,使用前在4 ℃條件下解凍。
海藻糖(食品級) 山東優索化工科技有限公司;牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA) 美國Sigma公司;Na2HPO4、NaH2PO4、H3PO4、NaCl(均為分析純) 天津市贏達稀貴化學試劑廠;MgCl2(分析純)天津市天大化工實驗廠;9 5%乙醇(分析純)天津市風船化學試劑科技有限公司;三聚磷酸鈉(sodium tripolyphosphate,STP)(分析純) 天津市光復精細化工研究所;CuSO4和酒石酸鉀鈉(均為分析純) 天津市科密歐化學試劑開發中心。
Hunter Lab色差儀 美國Hunter Lab公司;HW-S24電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司;H1650-W臺式高速離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司;IKA T10高速組織勻漿機 德國IKA公司;FA2004A電子天平 上海精天儀器有限公司;SMSTA TA-XT plus質構儀 英國Stable Micro System公司;Avanti J-E高效離心機 美國Beckman公司;UV-7504紫外-可見分光光度計 上海欣茂儀器有限公司;Model 2920差示掃描量熱儀 美國TA公司。
1.3.1 蝦蛄MP的提取
根據Park[15]、王詩萌[16]、袁程程[17]等的方法,先進行原料預處理,將蝦蛄從-80 ℃冰箱中取出,放置于4 ℃條件下解凍,然后去掉甲殼和頭,得到蝦蛄肉;先向其中加入4 倍體積的MP提取液(0.1 mol/L NaCl、0.002 mol/L MgCl2、0.1 mol/L Na2HPO4/NaH2PO4、0.001 mol/L EDTA,pH 7.0),高速勻漿30 s,在5 000 r/min、4 ℃條件下高速冷凍離心15 min;取沉淀,重復加MP提取液離心步驟2 次,然后再加入4 倍體積的0.1 mol/L NaCl溶液,高速勻漿30 s,在同樣條件下(5 000 r/min,15 min,4 ℃)高速冷凍離心3 次,棄上清,最終所得沉淀即為MP。
1.3.2 磷酸化MP的制備
參考王詩萌[16]的方法。取一定量MP,向其中加入適量2% STP溶液,分別制備20、40 mg/mL 2 種質量濃度的蛋白溶液;嚴格控制反應溫度在30 ℃,攪拌速率在中檔,時間2 h;攪拌完成后靜置一段時間,直至pH值穩定后,即可得磷酸化MP。
質量濃度為20 mg/mL的MP溶液用來測定乳化活性和乳化穩定性、濁度、表面疏水性、起泡性和泡沫穩定性以及進行差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry,DSC)掃描確定蛋白質的熱穩定性;質量濃度為40 mg/mL的MP溶液用來測定凝膠特性。
1.3.3 海藻糖的添加
用0.4 mol/L的NaCl溶液將質量濃度為20 mg/mL的磷酸化MP溶液稀釋至10 mg/mL,添加海藻糖,使其質量濃度分別為0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL,攪拌均勻,使海藻糖充分分散,35 ℃條件下水浴0.5 h,4 ℃保存備用,進行相關指標測定。向質量濃度為40 mg/mL的磷酸化MP溶液中添加海藻糖,使其質量濃度分別為0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL,攪拌均勻,在80 ℃條件下水浴0.5 h,快速冷卻,4 ℃保存備用。實驗前需將所制備的凝膠樣品取出,放置于室溫中30 min,再測定相關指標。
1.3.4 指標測定
1.3.4.1 蛋白質含量
參照曹云剛[18]、周非白[19]、李明清[20]等的方法,采用雙縮脲法測定從蝦蛄中提取出的MP含量。
雙縮脲試劑的配制:稱取酒石酸鉀鈉6 g和硫酸銅1.5 g,溶解于500 mL水中;邊攪拌邊加入300 mL質量分數為10%的NaOH溶液,然后用蒸餾水將溶液稀釋到1 000 mL,保存備用。
標準曲線的繪制:配制質量濃度為10 mg/mL的BSA溶液,分別吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于試管中,加蒸餾水補足到1 mL,然后添加雙縮脲試劑4 mL,振蕩均勻后,放置30 min,在540 nm波長處測定吸光度。以BSA的質量濃度為縱坐標,吸光度為橫坐標,繪制標準曲線。
樣品蛋白質含量測定:用0.5 mol/L NaOH溶液將待測樣品稀釋5 倍,向試管中加入1 mL稀釋樣品溶液,再向其中加入4 mL雙縮脲試劑,經上述同樣條件處理后比色,再將樣品溶液的吸光度代入標準曲線,可求出樣品的蛋白質含量。
1.3.4.2 磷酸化程度
參考周景麗[21]、彭倩[22]等的方法。將MP溶液在4 ℃條件下透析24 h后,采用鉬藍比色法測定蛋白磷酸化程度。
1.3.4.3 乳化活性和乳化穩定性
參考Agyare等[23]的方法。向50 mL燒杯中加入16 mL稀釋的MP溶液及4 mL大豆油,使用均質機高速勻漿2 min;均質后在0 min與10 min時分別從底部吸取100 μL混合液,加入到含有10 mL 0.1%十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)溶液的燒杯中,振蕩混勻;以0.1% SDS溶液為空白對照,在500 nm波長處測定吸光度。樣品的乳化活性(用乳化活性指數(emulsifying activity index,EAI)表示)和乳化穩定性(用乳化穩定性指數(emulsifying stability index,ESI)表示)按照公式(1)~(2)計算。

式中:ρ為溶液的蛋白質質量濃度/(g/mL);A0為0 min時乳狀液的吸光度;A10為10 min時乳狀液的吸光度;φ為油相體積分數(φ=0.2);n為稀釋倍數。
1.3.4.4 表面疏水性
參照Chelh[24]、吳菊清[25]等的方法。取稀釋的MP溶液2 mL并向其中加入400 μL質量濃度1 mg/mL的溴酚藍溶液,混合均勻;離心(4 000 r/min,20 min),取上清液,并將其稀釋10 倍,以對應的磷酸緩沖液為空白對照,在595 nm波長處測定吸光度。表面疏水基含量按照公式(3)計算。

式中:A對照為對照組的吸光度;A樣品為處理組的吸光度。
1.3.4.5 濁度
參照Benjakul等[26]的方法。向試管中加入5 mL稀釋的MP溶液,將其放置于60 ℃的水浴鍋中水浴30 min,取出后冷卻,再將溶液稀釋5 倍,在600 nm波長處測定吸光度(以不加MP的NaCl溶液為空白對照)。
1.3.4.6 起泡性和泡沫穩定性
參照李明清[20]的方法。取30 mL磷酸化MP溶液(V0)于100 mL量筒中,高速勻漿60 s,快速讀取泡沫的總體積(V1);之后將泡沫在室溫下靜置,分別讀取10、20、30 min時的泡沫總體積(Vt)。起泡性(foaming characteristics,FC)和泡沫穩定性(foam stability,FS)按照公式(4)~(5)計算。

1.3.4.7 凝膠保水性
參照Foegeding[27]的方法。取適量所制備的凝膠在4 ℃、80 000 r/min條件下離心10 min,按照公式(6)計算MP凝膠的保水性。

式中:m0為離心管質量/g;m1為離心前蛋白凝膠與離心管總質量/g;m2為離心后去掉上清液后蛋白凝膠與離心管總質量/g。
1.3.4.8 凝膠硬度
蛋白凝膠的硬度采用TA-XT plus型質構分析儀來測定。參數設置為:探頭:P/0.5;測前速率2.0 mm/s,測后速率1.0 mm/s,測試速率1.0 mm/s;觸發力5.0 g;觸發類型:自動。每個樣品做3 組平行。
1.3.4.9 凝膠彈性
參數設置為:探頭型號:P/0.5;測前速率2.0 mm/s,測后速率1.0 mm/s,測試速率1.0 mm/s;觸發力5.0 g;壓縮比50%。每個樣品做3 組平行。
1.3.4.10 凝膠白度值
參照袁程程等[17]的方法。采用全自動便攜式色差計測定蛋白的凝膠白度,記錄亮度值(L*)、紅度值(a*)和黃度值(b*)。按照公式(7)計算凝膠白度值。每個樣品做3 組平行。

1.3.4.11 DSC掃描
通過Model 2920差示掃描量熱儀分析經不同處理導致的MP熱穩定性差異。稱取10 mg/mL稀釋樣品16~18 mg,記錄其準確數值后,密封于鋁坩堝中,以空盒為空白,以10 ℃/min的升溫速率加熱,記錄30~75 ℃的DSC曲線[28]。加熱過程中MP的最大轉變溫度(Tmax)通過TA公司提供的Universal Analysis 軟件(版本1.2 N)進行分析。
采用SPSS 18.0軟件對數據進行顯著性分析,并采用Origin pro 8.0軟件和Excel 2010軟件處理數據并作圖。
蛋白質含量計算標準曲線方程為y=0.046 6x+0.011 8(R2=0.999 3),磷酸化程度計算標準曲線方程為y=8.361 0x+0.014 4(R2=0.999 8)。
由圖1可知:當海藻糖的添加量不斷增加時,磷酸化MP的乳化活性呈現先增加后逐漸降低的趨勢,當海藻糖的添加量為0.4 mg/mL時,磷酸化MP的EAI達到最大,為28.92 m2/g;當海藻糖的添加量不斷增加時,乳化穩定性則呈現逐漸增加的現象。這可能是由于當海藻糖溶于MP溶液后,通過與溶液中體系充分結合,會在蛋白質表面形成一種極為獨特的保護膜,能有效保護蛋白質分子結構,使其不變性失活,同時在均質后體系中距離較大的乳化微粒之間也可以起到某種乳化劑的作用,從而促進蛋白質的乳化活性及穩定性[29]。當海藻糖達到一定添加量時,由于其易于結晶,且結晶性能良好,使乳化膜的厚度逐漸增大并最終擴展至整個溶液,溶液中的海藻糖結晶會使乳化微粒之間的距離變得越來越小,降低乳化活性,而乳化穩定性則繼續增大[14]。

圖 1 海藻糖對蝦蛄磷酸化MP乳化活性和乳化穩定性的影響Fig. 1 Effect of trehalose on emulsifying activity and emulsion stability of phosphorylated MP

圖 2 海藻糖對蝦蛄磷酸化MP表面疏水性的影響Fig. 2 Effect of trehalose on surface hydrophobicity of phosphorylated MP
由圖2可知,蝦蛄磷酸化MP的表面疏水性隨著海藻糖添加量的增加呈現先增加后降低的趨勢,當海藻糖添加量為0.2 mg/mL時,表面疏水基含量最高,為103.34 μg。通過表面疏水性來評價MP的功能特性是目前非常普遍的一種途徑,具有重要的參考意義。蝦蛄磷酸化MP螯合溴酚藍的量越大,則表明其對應的表面疏水性越高,這是由于溶液中蛋白質的空間結構受MP分子間的相互作用以及蛋白質分子與水分子之間相互作用的直接影響,可能會導致磷酸化MP的功能性質變得不穩定。蛋白質的表面疏水性也可以同時反映其分子內部疏水基團的暴露程度,MP的表面疏水性越大,則表示蛋白質分子內部疏水基團暴露的越多。磷酸化MP在溶解的過程中也可能會由于分子間的聚合而發生不可逆變性,當海藻糖添加量較低時,磷酸化MP在加熱條件下與海藻糖作用發生變性,在蛋白質分子外部暴露大量表面疏水性基團,大量的溴酚藍聚合在一起,隨著海藻糖添加量的逐漸增大,磷酸化MP的變性程度相對逐漸降低,表面疏水性下降[24]。

圖 3 海藻糖對蝦蛄磷酸化MP濁度的影響Fig. 3 Effect of trehalose on turbidity of phosphorylated MP
濁度表示溶液中懸浮粒子的大小和數量,可以較為準確地反映蛋白質的聚集狀態。由圖3可知,當海藻糖的添加量不斷增加時,蝦蛄磷酸化MP的濁度先增加,然后逐漸降低,當海藻糖添加量為0.4 mg/mL時,MP的濁度達到最大,繼續增大海藻糖的添加量,濁度會逐漸下降。這可能是由于海藻糖具有較強的結晶性,當加入蛋白溶液時會產生一定量的結晶,同時阻止蛋白溶液之間的相互交聯,影響蛋白質的溶解性,導致蛋白質的吸光度逐漸增大[14]。當海藻糖的添加量逐漸增大時,其結構中的羥基可能與蛋白質結構中的極性殘基形成氫鍵,促進蛋白質的溶解性,吸光度逐漸降低。
蛋白質的起泡性與蛋白質分子表面的極性和分子大小相關,是蛋白質重要的功能特性之一,常用FC和FS來表示,它還與糖類的種類、鹽的種類和蛋白質的性質有關。
由圖4~5可知,隨著海藻糖添加量的增加,MP的FC和FS均呈現先增加后降低的趨勢。當海藻糖的添加量為0.4 mg/mL時,FC達到最大,為71.67%;繼續增大海藻糖添加量,FC和FS均呈下降趨勢。這可能是由于剛開始添加海藻糖時,糖類會與蛋白質發生特殊作用,形成特殊的穩定復合體,這種復合體可以提高蛋白質的起泡性和泡沫穩定性[20]。同時隨著海藻糖添加量的增加,溶液的黏度也會增大,也增大了蛋白質的起泡性。當海藻糖添加量增大到一定值時,由于其晶體析出性,會阻礙MP的起泡性和泡沫穩定性,導致蛋白質的起泡性和泡沫穩定性逐漸降低[14]。

圖 4 海藻糖對MP起泡性的影響Fig. 4 Effect of trehalose on foaming capacity of MP

圖 5 海藻糖對MP泡沫穩定性的影響Fig. 5 Effect of trehalose on foam stability of MP

圖 6 海藻糖對蝦蛄磷酸化MP凝膠保水性的影響Fig. 6 Effect of trehalose on water-holding capacity of phosphorylated MP gels
由圖6可知,磷酸化MP的凝膠保水性隨著海藻糖添加量的增大呈現先增加后降低的趨勢。當海藻糖添加量在0~0.4 mg/mL范圍內時,隨著海藻糖添加量的增大,凝膠保水性逐漸增加,并在添加量為0.4 mg/mL時達到最高,為89.46%;繼續增加海藻糖添加量,MP的凝膠保水性開始呈現逐漸降低的趨勢。這可能是由于海藻糖作為一種非還原性天然糖類,其結構為2 個葡萄糖分子通過1,1-糖苷鍵所連接,對很多生命體,尤其是海鮮具有很強的保護作用,會使凝膠網絡更好,孔隙更多,孔隙直徑更小,保水性也越來越好。因此,剛開始添加海藻糖時會提高磷酸化MP的凝膠保水性,當其添加量達到一定值時,海藻糖結構中的羥基可能會與MP結構中的極性殘基形成氫鍵,蛋白凝膠特性受氫鍵的影響非常大,可能會增強MP凝膠的硬度和破裂強度,但降低內聚性,導致蛋白凝膠變得更加疏松,凝膠保水性逐漸降低[14,30]。

圖 7 海藻糖對蝦蛄磷酸化MP凝膠硬度和彈性的影響Fig. 7 Effect of trehalose on hardness and springiness of phosphorylated MP gels
蛋白凝膠的硬度和彈性是衡量肌肉蛋白質凝結狀況的重要參數。由圖7可知,隨著海藻糖添加量的不斷增大,磷酸化MP凝膠的硬度先增加后逐漸降低,而彈性呈現逐漸增大的趨勢。當海藻糖添加量在0~0.4 mg/mL之間時,磷酸化MP凝膠的硬度隨著海藻糖添加量的增大而逐漸增加,并在添加量為0.4%時達到最大,為77.74 g,隨后呈現逐漸下降的趨勢;而磷酸化MP凝膠的彈性則隨著海藻糖添加量的增大而持續增加。這可能是由于海藻糖對于生命體,尤其是海產品具有非常強的保護作用,因此可以作為一種有效的低溫保護劑應用于海產品的研發、生產和運輸中,當其添加量在一定范圍內時,在蛋白質、水界面絕對抑制水的官能度時會持續增加MP的彈性、硬度和凝膠力[29]。同時,海藻糖結構中的羥基可能會與MP結構中的極性殘基形成氫鍵。蛋白質的凝膠特性受多種作用力的影響,其中氫鍵是主要作用力,它會使凝膠的硬度和破裂強度增大。繼續增加海藻糖的添加量,由于其具有較強的晶體析出性,會阻礙MP產生交聯,使之不能充分聚合形成三維蛋白網絡結構,影響凝膠形成,降低凝膠的硬度。

圖 8 海藻糖對蝦蛄磷酸化MP凝膠白度的影響Fig. 8 Effect of trehalose on whiteness of phosphorylated MP gels
由圖8可知,蝦蛄磷酸化MP凝膠的白度隨著海藻糖添加量的增加呈現先增加后降低的趨勢。當海藻糖添加量為0.4 mg/mL時,MP凝膠的白度值達到最大,為46.85,隨后白度值開始逐漸下降。總體上,與對照組相比,添加海藻糖之后凝膠的白度上升。這可能是由于海藻糖呈白色粉末狀態,且性質特別穩定,不會引起美拉德反應,當海藻糖的添加量達到一定值時,其結構中的羥基可能會與MP結構中的極性殘基形成氫鍵,導致凝膠保水性降低,白度值隨之降低[31]。

圖 9 添加海藻糖后的磷酸化MP的DSC掃描曲線Fig. 9 DSC of phosphorylated MP with added trehalose
DSC是評價蛋白質結構變化的重要途徑,圖9為磷酸化MP在30~75 ℃的DSC掃描曲線圖。在37 ℃和73 ℃左右,每條曲線均分別出現2 個較為明顯的峰,這表明蝦蛄磷酸化MP在這2 個溫度點發生了明顯變性。DSC掃描曲線中的峰向上表示吸熱,向下表示放熱。根據任麗娜[32]的研究可知,DSC掃描圖中從左至右的第1個峰和第2個峰與MP中肌球蛋白的變性相關,其分別代表肌球蛋白的球狀頭部和桿狀尾部。隨著海藻糖添加量的增加,每條DSC曲線上第1個熱吸收峰所對應的溫度點逐漸右移,從海藻糖添加量為0 mg/mL時的35.14 ℃右移至1.0 mg/mL時的36.48 ℃,其變性溫度越來越高,說明海藻糖的添加促進了磷酸化MP結構的穩定。添加海藻糖后,肌球蛋白尾部的熱吸收峰先變大后逐漸減小,而肌球蛋白頭部的熱吸收峰變化卻不明顯。當海藻糖添加量為0 mg/mL時,沒有明顯的肌球蛋白尾部熱吸收峰,但當海藻糖添加量在0.2~0.6 mg/mL之間時,肌球蛋白尾部的熱吸收峰均較為明顯,說明添加適量的海藻糖對磷酸化MP結構的穩定有非常大的促進作用[18-19,28,32]。
當海藻糖的添加量為0.4 mg/mL時,蝦蛄磷酸化MP的乳化活性達到最大,乳化穩定性則隨著海藻糖添加量的增加而逐漸增大,并在1.0 mg/mL時達到最大。蝦蛄磷酸化MP的表面疏水性隨著海藻糖添加量的增加呈現先增加后降低的趨勢,并在0.2 mg/mL時達到最大。當海藻糖的添加量逐漸增大時,蝦蛄磷酸化MP的濁度先增加后逐漸降低,在0.4 mg/mL時達到最大。MP的FC和FS隨著海藻糖添加量的增加均呈現先增加后降低的趨勢。當海藻糖的添加量為0.4 mg/mL時,FC達到最大,繼續增大海藻糖添加量,FC和FS均呈下降趨勢。隨著海藻糖添加量的增大,磷酸化MP凝膠的保水性呈現先增加后降低的趨勢,并在添加量為0.4 mg/mL時達到最高;凝膠硬度則呈現先增加后降低的趨勢,彈性逐漸增加;凝膠白度呈先增加后降低的趨勢。DSC曲線反映出添加適量的海藻糖有利于MP結構的穩定,使蛋白質的變性溫度逐漸上升。因此,添加適量的海藻糖可以顯著改善蝦蛄磷酸化MP的結構,促進蝦蛄制品的產業化發展。