發酵風干腸中乳酸菌的發酵性能

趙茉楠，韓 齊*，俞龍浩，張翼飛，蔣 奕

（黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319）

發酵作為一種便捷的食品加工及貯藏方式具有改善食品風味、提高營養品質、增強感官特性及延長食品保質期等優點。近年來，隨著發酵肉制品消費量的不斷增長，肉制品用功能性發酵劑的開發已經成為當前的研究熱點。乳酸菌是發酵肉制品中的優勢菌群，在發酵過程中可以作為發酵菌株與糖類發生化學反應，產生乳酸和乙酸等物質，并使蛋白質發生降解，產生豐富的氨基酸，使產品具有獨特的風味、顏色和質地[1-3]。同時，乳酸菌可以降低發酵過程中產生的有害化學物質（如亞硝酸鹽、生物胺等）的含量。段艷[4]的研究也表明，乳酸菌發酵產生的酸性環境有利于亞硝酸鹽的分解，對亞硝酸鹽含量的降低有促進作用，有助于減少亞硝酸鹽的殘留量。乳酸菌對腐敗菌和致病菌的生長繁殖也具有抑制作用，從而提高產品的安全性和穩定性，延長產品貨架期[5]。

乳酸菌作為公認的安全（generally recognized as safe，GRAS）生物，已成為醫藥和食品生產中使用最廣泛的益生菌[6-8]，具有抗氧化、免疫調節、減輕炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）癥狀、治療過敏和某些病毒腹瀉以及防止幽門螺桿菌的定殖等功能[9-11]。自然環境[12]、哺乳動物的腸道[13]和發酵食品（發酵肉制品、發酵乳和奶酪）[14-15]都是乳酸菌的良好來源，但是從肉制品中分離的乳酸菌更加適用于發酵肉制品的生產，其發酵性能和風味也要優于其他來源的菌株。趙俊仁[16]、Iboulet-Bisson[17]等已經從發酵香腸中分離出乳酸菌，并對其進行了鑒定。然而，從中國傳統發酵香腸中分離乳酸菌的研究報道較少。本研究對前期從天然發酵風干腸中分離出的6 株乳酸菌的發酵性能進行測定，從NaCl耐受能力、NaNO2耐受能力、產酸速率和生長情況方面進行評價，探究它們作為肉制品發酵劑的潛力，為發酵肉制品的生產提供新的發酵菌株和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種：植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）、清酒乳桿菌（Lactobacillus sake）、發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）和短乳桿菌（Lactobacillus brevis）均分離自自然發酵風干腸，由東北農業大學肉制品實驗室分離及保藏。

MRS肉湯培養基 廣東環愷微生物科技有限公司；蛋白胨水培養基、Kovacs氏靛基質試劑盒 青島高科技工業園海博生物技術有限公司；藥敏紙片（諾氟沙星、氧氟沙星、環丙沙星、紅霉素、阿莫西林、氨芐西林和鏈霉素） 杭州濱和微生物試劑有限公司；NaCl、NaNO2等均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Specord 210 plus紫外-可見分光光度計 德國耶拿分析儀器有限公司；Seven Multi pH S40綜合測試儀 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；LDZX-50 KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海電安醫療器械廠；SW-CJ-1 FD超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；SHP-250生化培養箱 上海森信實驗儀器有限公司；BCD-439wkk1FYM電冰箱 海信容聲（廣東）冰箱有限公司；VORTEX-5漩渦混合器 海門市其林貝爾儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株生長曲線及pH值測定

將活化后的6 株乳酸菌以3%接種量分別接種于無菌MRS肉湯培養基中，37 ℃條件下培養24 h，每隔4 h取發酵液，測定其600 nm波長處的吸光度（A）及pH值。以空白MRS液體培養基作為對照，繪制菌株生長曲線及pH值變化曲線。

1.3.2 菌株NaCl耐受能力測定

將活化后的6 株乳酸菌以3%接種量分別接種于NaCl質量濃度為0、2、4、6 g/100 mL的無菌MRS肉湯培養基中，37 ℃條件下培養24 h后取發酵液，測定其600 nm波長處的吸光度，按照公式（1）計算存活率。

式中：A1為NaCl質量濃度為2、4、6 g/100 mL時的吸光度；A0為NaCl質量濃度為0 g/100 mL時的吸光度。

1.3.3 菌株NaNO2耐受能力測定

將活化后的6 株乳酸菌以3%接種量分別接種于NaNO2質量濃度為0、0.005、0.010、0.015 g/100 mL的無菌MRS肉湯培養基中，37 ℃條件下培養24 h后取發酵液，測定其600 nm波長處的吸光度。按照公式（2）計算存活率。

式中：A1為NaNO2質量濃度為0.005、0.010、0.015 g/100 mL時的吸光度；A0為NaNO2質量濃度為0 g/100 mL時的吸光度。

1.3.4 吲哚實驗

無菌條件下，將活化后的6 株乳酸菌以3%的接菌量分別接種于蛋白胨水培養基中，37 ℃條件下培養72 h，加入吲哚試劑8～10 滴，同時用大腸桿菌（Escherichia coli）做空白實驗，觀察實驗結果。

1.3.5 菌株對抗生素的敏感性實驗

采用平板藥敏紙片擴散法對乳酸菌的抗生素敏感性表型進行評價，分別檢測對諾氟沙星、氧氟沙星、環丙沙星、紅霉素、阿莫西林、氨芐西林和鏈霉素的敏感性。將不同藥敏紙片放置于涂布乳酸菌的固體平板上，以無菌水紙片作為對照。將培養皿置于37 ℃條件下培養24 h，測量藥敏紙片周圍光圈的大小。

1.4 數據處理

所有實驗均重復測定3 次，每個處理組做3 個平行，數據表示為平均值±標準差。采用Statistix 8.1軟件進行數據統計分析，差異顯著性分析（P＜0.05）采用Tukey HSD程序進行；采用Sigmaplot 12.5作圖軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的生長情況

用作肉制品發酵劑的乳酸菌要求具有較強的生長繁殖能力，乳酸菌在快速生長繁殖過程中產生的乳酸和細菌素等可以降低發酵肉制品的pH值和亞硝酸鹽含量，減緩甚至阻止N-亞硝胺的形成，并抑制發酵香腸中腐敗菌的生長[18]。

圖 1 乳酸菌的生長曲線Fig. 1 Growth curves of lactic acid bacteria

由圖1可知，6 株乳酸菌的生長曲線總體趨勢相似。在0～8 h以內菌株迅速生長繁殖，菌體濃度顯著增加（P＜0.05），戊糖片球菌和短乳桿菌8 h后生長趨于平緩，進入穩定生長期，植物乳桿菌、彎曲乳桿菌、清酒乳桿菌和發酵乳桿菌在8 h后生長均呈現小幅度上升，12 h后生長趨于平緩。植物乳桿菌、彎曲乳桿菌、清酒乳桿菌和發酵乳桿菌的菌體濃度略高于戊糖片球菌和短乳桿菌，說明植物乳桿菌、彎曲乳桿菌、清酒乳桿菌和發酵乳桿菌的生長情況較好。李利等[19]研究得出，L. plantarum SN1在生長2 h后進入對數期，16 h后達到穩定期，與本研究結果基本一致。

2.2 乳酸菌的產酸能力

pH值是監測肉類發酵程度的重要參數[20]。乳酸菌可以在發酵過程中產生大量的有機酸（主要是乳酸）和其他代謝物，這是導致發酵產品pH值降低的主要原因。酸性環境不僅對乳酸菌的抑菌活性起到重要的作用，對亞硝胺的積累也有顯著影響，氨基酸脫羧酶陰性啟動子培養物會使pH值快速下降，羧化酶陽性細菌的生長受限，導致發酵香腸中亞硝胺的積累量降低[21]。

圖 2 乳酸菌生長過程中的pH值變化Fig. 2 Changes in pH value during growth of lactic acid bacteria

由圖2可知，6 株乳酸菌培養24 h期間的pH值變化趨勢相似。0～8 h，乳酸菌發酵液pH值顯著下降（P＜0.05），由6.0下降至4.2左右，這是由于在此期間菌株處于對數生長期，代謝旺盛，生長繁殖較快，分解糖類物質產生大量乳酸，使pH值迅速降低。其中，戊糖片球菌和短乳桿菌發酵液的pH值下降最快。12 h后各菌株的產酸速率趨于平緩，發酵液的pH值為3.9左右。從產酸角度來看，清酒乳桿菌和發酵乳桿菌的pH值呈現下降趨勢且下降程度最大，產酸性能最好。Gao Yurong等[22]的研究也表明，乳酸菌產生的代謝產物的抑菌作用在pH值小于5.5時更有效。Lee等[23]從泡菜中分離出的彎曲乳桿菌、植物乳桿菌和清酒乳桿菌在發酵香腸的生產過程中表現出相對良好的應用潛力，具有較好的生長能力和產酸能力，與本研究結果一致。乳酸菌具有較強的產酸能力有助于保證發酵肉制品的安全性。

2.3 乳酸菌的NaCl耐受能力

NaCl是發酵肉制品中必不可少的添加物，在發酵肉制品中添加一定量的NaCl可賦予產品良好的感官和質構品質，并具有防腐保鮮的作用[24-26]。發酵肉制品生產中NaCl的添加量通常為2.5～3.0 g/100 mL，但隨著發酵的進行，產品水分活度降低，NaCl含量會有不同程度的升高，因此，作為肉制品發酵劑使用的乳酸菌需要耐受一定濃度的食鹽[27]，本研究使用的NaCl質量濃度最大為6 g/100 mL。

表 1 乳酸菌在不同質量濃度NaCl下的存活率Table 1 Survival rates of lactic acid bacteria at different concentrations of NaCl%

由表1可知：隨著培養基中NaCl質量濃度的增加，6 株乳酸菌的存活率均顯著下降（P＜0.05）；當NaCl的質量濃度為2 g/100 mL時，植物乳桿菌和彎曲乳桿菌的存活率最高，可達99.77%左右，其他菌株的存活率也均在95%以上；當NaCl的質量濃度為4 g/100 mL時，植物乳桿菌和彎曲乳桿菌的存活率仍顯著高于其他菌株，可達97%左右，其他菌株的存活率均在87%以上，表明NaCl的質量濃度為4 g/100 mL時已經顯著影響乳酸菌的生長（P＜0.05）；當NaCl的質量濃度達到6 g/100 mL時，植物乳桿菌和彎曲乳桿菌的存活率仍可達86%以上，清酒乳桿菌和發酵乳桿菌的存活率最低，約為60%左右，表明此時各菌株的生長受到較大程度的抑制，但仍能生長。因此，植物乳桿菌和彎曲乳桿菌具有較高的NaCl耐受能力，其他乳酸菌的生長雖然受到不同質量濃度NaCl的抑制，但也可以保持一定程度的生長。Drosinos等[28]從一種希臘發酵香腸中分離出107 株植物乳桿菌、21 株彎曲乳桿菌和12 株清酒乳桿菌，并對其進行耐鹽性實驗，發現清酒乳桿菌、植物乳桿菌和彎曲乳桿菌能夠耐受8 g/100 mL的食鹽，與本研究結果基本一致。

2.4 乳酸菌的亞硝酸鹽耐受能力

亞硝酸鈉作為肉類加工過程中重要成分，可與肌紅蛋白反應形成亞硝基肌紅蛋白，是肉制品形成特征粉紅色的原因，亞硝酸鈉還具有抑制有害微生物、延緩脂質氧化和形成肉類特殊風味的重要作用[29]。乳酸菌具有硝酸鹽和亞硝酸鹽還原酶活性的能力是篩選用于發酵香腸生產發酵劑的選擇標準之一[30]。GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》規定，亞硝酸鹽在肉制品的最大使用量為0.015 g/100 mL，因此，作為肉制品發酵劑的乳酸菌必須能夠耐受一定質量濃度的亞硝酸鹽，否則亞硝酸鹽的加入會抑制發酵微生物的生長繁殖，影響正常發酵。

表 2 乳酸菌在不同質量濃度NaNO2下的存活率Table 2 Survival rates of lactic acid bacteria at different concentrations of NaNO2%

由表2可知，隨著NaNO2質量濃度的增加，6 株乳酸菌的生長均受到顯著抑制（P＜0.05），并且菌株之間也具有顯著差異（P＜0.05）。當NaNO2質量濃度為0.005 g/100 mL時，各菌株耐受能力均較強，植物乳桿菌和彎曲乳桿菌的存活率高達99%以上，其他菌株均在97%左右；當NaNO2質量濃度為0.010 g/100 mL時，植物乳桿菌和彎曲乳桿菌的存活率仍在98%以上，相比其他菌株仍具有較高的耐受性，除了彎曲乳桿菌和清酒乳桿菌的存活率隨著NaNO2質量濃度的增加未發生顯著變化外，其他菌株均顯著下降（P＜0.05）；當NaNO2質量濃度為0.015 g/100 mL時，不同質量濃度的亞硝酸鹽對各菌株的影響與質量濃度0.010 g/100 mL相比顯著降低（P＜0.05），清酒乳桿菌和發酵乳桿菌的存活率在95%左右。以上結果表明，6 株乳酸菌在不同質量濃度亞硝酸鹽條件下的生長能力顯著下降，但仍能生長，表明分離的乳酸菌具有良好的亞硝酸鹽耐受性，可作為肉制品發酵劑使用。

2.5 吲哚實驗結果

向培養好的菌液中滴加指示劑后，E.coli空白組的蛋白胨水培養基上部出現紅色圓環，6 株乳酸菌菌株（L. plantarum、L. curvatus、L. sake、L. fermentum、P. pentosaceus、L. brevis）的吲哚實驗結果均呈陰性，蛋白胨水培養基上部出現黃色圓環，說明未產生吲哚類物質。吲哚實驗可以檢測菌株是否能分解蛋白質中的色氨酸。色氨酸為人體必需氨基酸，參與人體蛋白質合成、調節免疫功能和促進消化。色氨酸代謝過程發生障礙會引起肝功能衰退、惡性腫瘤等疾病。吲哚實驗結果表明，6 株乳酸菌菌株不會分解色氨酸產生吲哚。

2.6 藥敏實驗結果

表 3 乳酸菌對6 種抗菌藥的敏感性Table 3 Sensitivity of lactic acid bacteria to six antimicrobial agents

由表3可知：6 株乳酸菌對氧氟沙星、諾氟沙星、阿莫西林（青霉素類藥物）、紅霉素（大環內酯類藥物）和氨芐西林均敏感；除短乳桿菌對環丙沙星中度敏感外，其余菌株均為敏感；植物乳桿菌和戊糖片球菌對鏈霉素（氨基糖苷類藥物）有抗性，清酒乳桿菌、發酵乳桿菌和短乳桿菌對鏈霉素中度敏感，其余菌株對鏈霉素均敏感。

3 結 論

本研究對分離自自然發酵風干腸的6 株乳酸菌的產酸能力、生長曲線、對NaCl及NaNO2的耐受能力進行評價，結果表明：植物乳桿菌、彎曲乳桿菌、清酒乳桿菌和發酵乳桿菌的生長情況更好，清酒乳桿菌和發酵乳桿菌的pH值在發酵過程中下降最快且程度最大，產酸性能最好；植物乳桿菌和彎曲乳桿菌具有較強的NaCl耐受能力，清酒乳桿菌和發酵乳桿菌具有較強的NaNO2耐受能力；同時通過體外安全性實驗中的吲哚實驗和耐藥性檢測，初步證明了6 株乳酸菌的安全性，它們均可以作為潛在的肉制品發酵劑應用于發酵肉制品的生產中。