Chaotropic離子對肌球蛋白乳化特性影響的研究進展

李儒仁，楊 鵬，榮良燕，賈 娜，何 青，邵俊花，劉登勇*

（渤海大學食品科學與工程學院，生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心，遼寧 錦州 121013）

乳化型肉制品是優質蛋白的良好來源，但其食鹽含量遠高于植物蛋白制品和乳制品[1]。近年來的科學研究表明，長期攝入高鹽食品容易引發高血壓等心腦血管疾病[2]，而降低食品中的食鹽含量會顯著降低食品品質及口感，因此在保證食品品質和口感的同時降低食品中的食鹽含量是目前食品科學研究的重點。

蛋白質變性過程中離子發揮重要作用，將離子按照它們促使蛋白質變性能力的大小或起變性作用時濃度的大小排序，就構成霍夫梅斯特序列（如SO42－＞Cl－＞NO3－＞I－＞ClO4－＞SCN－，即促使蛋白質變性的能力由強到弱）。依據霍夫梅斯特序列，Cl－、L-精氨酸、L-賴氨酸及L-組氨酸等均屬于Chaotropic離子，這類離子具有降低蛋白質表面張力、提高蛋白質溶解度以及促使蛋白質變性的能力[3-4]。研究表明，Cl－溶解肌球蛋白所需的濃度遠高于L-組氨酸[5]、L-賴氨酸[6]和L-精氨酸[7]，且L-賴氨酸、L-組氨酸可以同其他Chaotropic離子協同改變肌球蛋白的二級結構[8-9]。由此可見，Chaotropic離子能夠影響肌球蛋白的乳化穩定性，進而影響乳化型肉制品的保油保水性。

目前，我國低鹽乳化型肉制品的加工普遍存在保油保水性差的問題[10]，主要原因在于減鹽會影響肌球蛋白等肌肉蛋白質的乳化凝膠特性。而L-組氨酸等Chaotropic離子能夠在低濃度條件下改變肌球蛋白的二級結構，這類在低濃度條件下發揮作用的Chaotropic離子可以為乳化型肉制品減鹽提供新的思路。本文結合國內外相關研究進展，以離子和蛋白質的相互作用為出發點，討論Chaotropic離子影響肌球蛋白乳化穩定性的機理，并對未來的研究方向進行展望。

1 蛋白質乳化特性的影響因素

1.1 乳化機理

肉糜是由蛋白質、脂肪、水、鹽等組成的混合物，肉糜加工過程中蛋白質和脂肪間發生乳化作用，形成界面蛋白膜，這是維持肉糜乳化穩定性、減少產品汁液流失的關鍵[11]。界面蛋白膜的形成涉及2 個重要環節：一是兩親性肌球蛋白吸附至脂肪球表面，形成肌球蛋白單分子層，其親水氨基酸趨向水相，疏水氨基酸趨向油相[12]；二是其他鹽溶性肌原纖維蛋白通過共價或非共價相互作用與肌球蛋白尾部交聯[13]，在脂肪球周圍形成蛋白質外殼，提供靜電斥力和空間位阻，防止乳滴聚集[14]（圖1）。由此可見，肌球蛋白在脂肪球表面的吸附行為對肉糜的乳化穩定性至關重要。

圖 1 肉糜乳化體系中界面蛋白膜形成示意圖[11]Fig. 1 A diagram: the formation of interfacial protein membrane in meat batters[11]

蛋白質在脂肪球表面的吸附行為主要涉及2 個關鍵的分子活動：蛋白質在脂肪球表面的吸附“定向”以及蛋白質的“構象重排”[15-16]。蛋白質與脂肪球之間的靜電相互作用是誘導吸附“定向”的主要驅動力[17]，吸附后蛋白質定向排列于脂肪球表面，彼此之間通過共價鍵（二硫鍵）連接在一起[15]；“構象重排”主要涉及蛋白質空間構象（α-螺旋、β-折疊等）的變化[18-19]。由此可見，蛋白質乳化脂肪的效果取決于蛋白質在脂肪球表面的吸附“定向”和“構象重排”，能夠影響這2 個關鍵活動的因素均有可能影響蛋白質對脂肪的乳化效果。

1.2 鹽對蛋白質乳化特性的影響

脂肪球表面形成界面蛋白膜的厚度主要取決于提取的肌原纖維蛋白含量[11]。食鹽可以通過改變電荷、水合作用以及水分子的結構，進而影響肌原纖維蛋白的構象，使其產生鹽溶或鹽析現象[20]。食鹽中Cl－易于滲透進入肌原纖維蛋白內部，與正電殘基結合，增大蛋白質的膨脹度，提高蛋白質結合水的能力及蛋白質間的靜電排斥力，進而達到“鹽溶”的目的，并且在食鹽的誘導下形成具有構象柔性的蛋白質，能更好地分布于油-水界面[2,21-22]。

不同類型氯化鹽制備得到的乳化型肉制品微觀結構不同。例如，相比于CaCl2和MgCl2，添加NaCl制備形成的肉糜中包含的脂肪球表面更加光滑[23]。Gravelle等[24]指出，穩定肉糜中存在更多表面光滑的乳滴，形成的界面蛋白膜孔隙較小且更厚，不穩定肉糜中形成的乳滴界面蛋白膜較薄且表面孔洞較大。Gordon等[25]發現，鹽的種類影響肌肉蛋白的提取種類和數量，對后期肉糜的穩定性有較大影響。添加一定量KCl、NaCl或LiCl提取出的肌肉蛋白質組分具有一定相似性，含有較多肌動球蛋白和肌球蛋白，這類蛋白質在乳化過程中發揮重要作用，形成的肉糜穩定性較好，而添加CaCl2和MgCl2形成的肉糜孔隙更多，穩定性更差[12,25-26]。通常，單價氯化物能改善肉糜的保水性和質地，二價氯化物則會降低肉糜的保水性[27-28]。由于不同離子對蛋白質的構象具有不同影響，故不同單價氯化物對肌肉蛋白構象的影響及形成肉糜的保水性、質地等存在差異[23,25-26]。

1.3 淀粉對蛋白質乳化特性的影響

淀粉常作為增稠劑改善肉制品的結構組織、外觀形狀和出品率等[29]。淀粉能吸收一定量水分，通過物理擠壓的方式擠壓蛋白質，與其形成緊密的網狀結構[30]，但過多的淀粉會導致肉糜制品出現軟塌現象。另外，淀粉分解得到的糖類物質能與蛋白質發生糖基化作用，改變蛋白質的功能特性，如溶解度、持水力和乳化性能[31]。Katayama等[32]的研究表明：糖基化作用使還原糖與肌球蛋白（尾部）表面帶正電的賴氨酸殘基結合，導致肌球蛋白尾部正電荷減少，負電荷相對增多，肌球蛋白分子間可以通過靜電排斥作用分散到水相中；另外，結合在肌球蛋白表面的還原糖形成物理屏障，抑制肌球蛋白纖維聚集，有利于發揮其功能特性。Youssef等[33]利用糖基化反應將蛋白質改性，有效提高了減鹽條件下肌原纖維蛋白的溶解度和熱穩定性。此外，糖基化可以增強肌原纖維蛋白的構象柔性，還原糖的結合又提供了空間位阻，從而提升了肌原纖維蛋白的乳化性能[34]。

1.4 脂肪對蛋白質乳化特性的影響

脂肪屬性影響乳化型肉制品品質的研究主要集中于飽和脂肪的替代對肌肉蛋白質乳化性能的影響[33-36]。采用液態植物油替代動物脂肪后形成不穩定肉糜，造成嚴重的蒸煮損失[34]，表明油脂類型不同時，蛋白質的乳化模式不同；但是，將植物油凝膠化替代動物脂肪可以有效改善乳化型肉制品的質地和蒸煮損失[36]。例如，Barbut等[35]用含有8%乙基纖維素和1.5%或3.0%山梨醇單硬脂酸酯制備得到的菜籽油膠體替代牛脂肪，結果表明，替代前后的產品具有相似的感官品質和質地。由此可見，固態脂肪有利于蛋白質發揮功能特性。另外，將植物油預乳化后添加到肉糜中也可以改善直接添加植物油進行乳化造成的缺陷[37-38]。

在完整的肉糜體系中，肌原纖維蛋白通過二硫鍵的連接形成凝膠網絡，包裹脂肪球[13,39]。在流變學意義上，這些脂肪球可以作為填充物增強凝膠網絡的強度，但是肌肉蛋白如何強烈吸附在脂肪球表面還未被明確界定。另外，脂肪屬性和蛋白質構象變化的關系仍有待深入研究。

1.5 斬拌條件對蛋白質乳化特性的影響

斬拌是穩定肉糜體系的關鍵步驟，斬拌時間、溫度和速率的控制在肉糜制品生產過程中至關重要[40]。適宜的斬拌時間不僅能增加鹽溶性蛋白的溶出率，還能提高蛋白質的乳化凝膠特性。斬拌時間過短，肌原纖維蛋白不能充分發揮乳化作用；斬拌時間過長，部分蛋白質過度變性，降低肌原纖維蛋白在脂肪球表面的黏著力[41]，易造成產品脂肪流失。斬拌過程中的溫度與產品的質構、感官品質和保油保水性等均有直接關系，適當升溫可以加速鹽溶性蛋白的溶出；但溫度過高不僅使蛋白質變性，失去乳化特性，加速蛋白質凝固，還會增加脂肪的流動性，導致產生蒸煮損失[42-43]。斬拌速率對肉糜穩定性的影響趨勢與斬拌時間和斬拌溫度類似。隨著斬拌速率的提高，脂肪顆粒逐漸減小，相對面積增大，此時需要更多鹽溶性蛋白將其乳化。斬拌的目的之一是打破結締組織對肌纖維的束縛，因此調控斬拌速率可以優化溶出蛋白和脂肪的比例，提高肉糜保油保水性[44]。隨著斬拌的進行（即能量增加），蛋白質-溶劑系統的自由能圖譜變得相對平坦，蛋白質逐漸失去二級和三級結構，導致蛋白質變性，解折疊的蛋白質能在平坦的自由能表面“游蕩”，最終形成大量無規卷曲結構；在能量變化過程中，蛋白質可呈現多種狀態，如熔球態、轉換態及玻璃態[45]。因此，建立蛋白質狀態-斬拌參數之間的相互關系對控制肉糜穩定性具有重要作用。

2 Chaotropic離子對肌球蛋白空間構象的影響

鹽離子是蛋白質乳化特性的重要影響因素之一，鹽離子如何影響蛋白質分子空間構象的相關機理仍存在爭議。Chaotropic離子（K＋、Cl－、L-精氨酸、L-賴氨酸及L-組氨酸等）能夠影響蛋白質的空間構象，但不同離子對其空間構象的影響存在很大差異[3,5-8]。Chen Xin等[5]研究發現，在“Chaotropic離子-肌球蛋白”混合體系中，高鹽濃度條件下（0.6 mol/L KCl），肌球蛋白以單體形式存在，并保持其天然構象，而在低濃度條件下（1 mmol/L KCl），肌球蛋白發生聚集，溶解度較低。然而，當該體系中加入L-組氨酸（5 mmol/L）時，溶解度增高，并且L-組氨酸中的咪唑環會誘導肌球蛋白輕鏈部分解螺旋（α-螺旋含量下降），同時使其疏水基團和活性巰基數量增加。Chaotropic離子對蛋白質空間構象的調控途徑存在3 種可能[3,46]：Chaotropic離子與蛋白質不發生直接相互作用，而是與蛋白質周圍的水分子發生相互作用，間接影響蛋白質的構象；Chaotropic離子通過改變維持蛋白質空間構象的作用力（氫鍵、靜電吸引力及疏水作用等），進而影響蛋白質的構象；Chaotropic離子與蛋白質氨基酸殘基發生特異或非特異性結合，影響蛋白質的構象。

近年來，Chaotropic離子與蛋白質相互作用的機理被不斷揭示[8-9,47-50]，其中L-組氨酸與肌球蛋白之間的相互作用成為食品領域的主要研究對象之一，目前主要包括以下幾個理論。

2.1 結構失衡理論

低離子強度條件下（含5 mmol/L L-組氨酸），肌球蛋白溶解度顯著提高（＞80%）[48,51]。Hayakawa等[48]研究L-組氨酸如何影響肌球蛋白在低離子強度溶液中的溶解度，通過掃描電鏡發現，低離子強度溶液（含5 mmol/L L-組氨酸）中，肌球蛋白尾部延長（圖2～3）。肌球蛋白桿狀部分（尾部）的氨基酸序列具有高度周期性，尾部的螺旋線圈式結構由多個7肽重復區構成[51-53]。桿狀部分中存在以28 個殘基為單位形成的重復區，其中均勻分布著帶電殘基，并且負電殘基多于正電殘基，而疏水殘基相對較少，疏水性較弱[8,54]，這在肌球蛋白的聚集過程中發揮著重要作用。當然，肌球蛋白的聚集需要另一個肌球蛋白分子C-端有限個殘基構成的ACD域參與，以平行或反平行的形式聚集[55-56]。因此，Hayakawa等[48]認為，L-組氨酸的添加使肌球蛋白的尾部伸長，破壞了肌球蛋白尾部帶電殘基肽段的電荷平衡，從而抑制了肌球蛋白的聚集，提高了溶解度。

圖 2 L-組氨酸對肌球蛋白形態的影響[48]Fig. 2 Effect of L-histidine on myosin morphology[48]

圖 3 L-組氨酸對肌球蛋白長度的影響[48]Fig. 3 Effect of L-histidine on myosin morphology length[48]

2.2 靜電排斥理論

圖 4 低離子強度條件下肌球蛋白溶液（pH 7.5）的Zeta電位[5]Fig. 4 Zeta potential of myosin (pH 7.5) at low ionic strength[5]

Chen Xin等[5]測得低離子強度條件下添加L-組氨酸增大了肌球蛋白表面的絕對Zeta電位值（圖4），并指出L-組氨酸中的咪唑環發揮了主要作用。L-組氨酸的存在使肌球蛋白發生構象重排，這種構象重排方式改變了肌球蛋白表面帶電殘基的分布，導致表面絕對Zeta電位值升高。

低離子強度條件下（pH 7.5），肌球蛋白表面絕對Zeta電位值相對較低，因此容易聚集形成纖維態，溶解度降低；當添加5 mmol/L L-組氨酸時，肌球蛋白尾部解折疊，α-螺旋含量降低（可能是親核的咪唑環破壞了蛋白質殘基間的氫鍵），但L-組氨酸（或咪唑環）以何種形式改變肌球蛋白的構象并不明確。內源性熒光的測定結果表明，L-組氨酸的添加使熒光光譜發生紅移，說明天然肌球蛋白變性后部分埋藏的色氨酸殘基暴露在極性環境中[57]。但無法確定三級結構的變化源自肌球蛋白頭部還是尾部。另外，L-組氨酸的存在使肌球蛋白表面絕對Zeta電位值顯著增大，帶負電的肌球蛋白通過靜電排斥作用以單分子形式分布于水相（圖5）。Chen Xin等[5]認為，肌球蛋白尾部固有的正電和負電結構域是造成肌球蛋白聚集的主要原因。L-組氨酸中的咪唑環通過某種方式破壞了肌球蛋白原有的平衡結構，改變了肌球蛋白表面帶電殘基的分布，使肌球蛋白解聚及單體間通過靜電排斥溶解于低濃度鹽溶液。

圖 5 低離子強度條件下L-組氨酸（5 mmol/L）促進肌球蛋白溶解的原理示意圖（1 mmol/L KCl，pH 7.5）[5]Fig. 5 Proposed mechanism of solubilisation of myosin at low ionic solution (1 mmol/L KCl, pH 7.5) in the presence of 5 mmol/L L-histidine[5]

2.3 靜電吸附理論

圖 6 L-組氨酸與肌球蛋白相互作用的原理示意圖[47]Fig. 6 Proposed mechanism of interaction between L-histidine and myosin[47]

Guo等[6]認為，pH 6.5時L-組氨酸帶正電，而肌球蛋白帶負電，二者優先通過靜電吸引力相互作用，隨后L-組氨酸破壞肌球蛋白負電殘基，導致肌球蛋白α-螺旋結構含量下降，并伴隨著β-折疊、β-轉角和無規卷曲結構含量的增加。不僅如此，肌球蛋白構象變化導致疏水基團和部分活性巰基暴露。崔艷飛[44]的研究表明，表面疏水性會隨著α-螺旋結構含量的下降而增強，隨后的構象轉變誘導肌球蛋白聚集體解聚，因此肌球蛋白溶解性提高。鹽離子與蛋白質的特異性和非特異性結合擾亂了靜電相互作用可能是導致α-螺旋減少、促進肌球蛋白溶解的重要因素[58]。但目前對于疏水基團暴露引起的疏水相互作用增加沒有使肌球蛋白有效聚集這一現象尚無定論。Gao Ruichang等[47]認為，L-組氨酸能通過靜電吸引嵌入肌球蛋白尾部，在疏水基團周圍形成“架空層”，屏蔽疏水基團之間的相互作用力，使肌球蛋白在疏水性較強的條件下無法發揮疏水相互作用，并且該狀態下肌球蛋白加熱后形成的聚集體較小（圖6）。以此解釋了肌球蛋白疏水性增強卻無明顯聚集體形成的原因。

3 離子種類對溶質性質的影響

肉糜斬拌過程中，隨著NaCl添加量的增加，肌原纖維蛋白溶解度增大，表面張力下降，活性巰基含量增加，乳化穩定性逐漸提高[59]。肉糜乳化體系中不同濃度的離子會誘導肉糜中的蛋白質構象發生不同變化，從而導致產品質構和保油保水性出現差異[60-62]。說明肉糜體系的乳化穩定性、蛋白質構象變化、離子屬性三者之間存在一定關系，而準確理解三者的關系將有助于構建穩定肉糜體系，達到乳化型肉制品減鹽的目的。

目前，離子影響肉糜乳化穩定性的研究主要集中在NaCl、KCl等[59]對肌原纖維蛋白乳化穩定性[60-61]、乳化能力[62-64]和二級結構[65-67]等方面的影響，較少涉及L-組氨酸和L-賴氨酸等Chaotropic離子。雖然低濃度L-組氨酸、L-賴氨酸等Chaotropic離子會影響肌球蛋白的溶解度和空間構象[5,6,9]，但具體機理并不清楚。因此，有必要深入研究不同Chaotropic離子與蛋白質相互作用的機理，從而揭示蛋白質構象變化如何影響肉糜穩定性。

Chaotropic離子屬于霍夫梅斯特序列離子，與其相對應的還有Kosmotropic離子，前者能夠破壞氫鍵使蛋白質構象改變，后者可以調控氫鍵使蛋白質結構穩定。Chaotropic離子（L-組氨酸）確實能夠與蛋白質發生特異性或非特異性結合，改變其性質，但缺乏對離子所處水環境的考慮。由于霍夫梅斯特序列離子具有破壞/增強氫鍵的能力[49,68]，因此，可能存在新的假設，即離子通過調控水化層結構影響肌球蛋白構象或改變氫鍵網絡驅動離子進入蛋白質內部，改變肌球蛋白的構象。

3.1 間接作用

親水/疏水物質進入水相，均會與水分子發生強烈相互作用。Collins[68]認為，當Kosmotropic離子分散到體相水中后，溶質過渡層的水分子被Kosmotropic離子“吸引”，與水化層中水分子的相互作用減弱，導致溶質界面水化效應減小，出現鹽析現象；當Chaotropic離子進入體相水時，因其極化率高，能夠破壞氫鍵并排斥水分子，有助于過渡層水分子與水化層水分子結合，增強水化效應，促進溶質溶解。另外，不同種類的Chaotropic/Kosmotropic離子與水分子相互作用的程度不同，符合霍夫梅斯特離子序列。Lee等[49]用分子模擬表征霍夫梅斯特序列陰離子與泛素蛋白界面間的相互作用，發現BF4－、SCN－和ClO4－等Chaotropic離子并不直接與蛋白質表面發生作用，而是通過破壞泛素蛋白表面水分子間的氫鍵網絡間接影響蛋白質的構象。由此可見，離子與水分子的相互作用會間接影響溶質的狀態。

3.2 直接作用

盡管間接作用機理在一定程度上能夠解釋霍夫梅斯特離子效應，但仍存在很多疑問。Omta等[69]利用飛秒二色泵浦探測光譜測定鹽溶液中水分子的取向遷移相關時間，發現即使在高鹽濃度下，本體水的動態也不受影響，說明水分子氫鍵未發生改變。Chen等[70]運用和頻振動光譜研究聚（N-異丙基丙烯酰胺）水溶液表面水分子的羥基伸縮振動隨無機鹽種類的變化，發現SCN－因其體積大、極化率高而容易發生去水化，去水化后的SCN－可以直接吸附到PNIPAM表面。Willow等[50]運用Born-Oppenheimer分子動態模擬發現，Chaotropic陰離子（ClO4－）與蛋白質肽段上的帶電殘基直接發生相互作用，通過破壞殘基間的氫鍵進入殘基內部，使蛋白質解折疊。以上研究均對間接作用機理提出了質疑，并且越來越多實驗證據表明直接作用是離子與溶質相互作用的主要機理。

4 結 語

近年來，隨著乳化型肉制品消費的快速增長，肉制品中蛋白質的乳化特性逐漸成為我國肉品科研領域的研究熱點。但在食品健康的大背景下，有關肉制品低鹽乳化的研究較少，且主要集中在食鹽替代對肉糜產品質構、保油保水性等的影響。Chaotropic離子能夠影響肌球蛋白的空間構象，改變其乳化特性，進而對乳化型肉制品的保油保水性產生一定影響。因此，明確Chaotrapic離子改變肌球蛋白空間構象及影響肌球蛋白在脂肪球表面吸附的具體機理有助于改善肉糜凝膠基質的保油保水性。

“結構決定功能”，明確離子引起的蛋白質動態變化有助于理解加工過程中影響肉糜穩定性的因素。因此，有必要分析乳化過程中不同Chaotropic離子誘導下肌球蛋白空間構象的變化規律，確定乳化過程中Chaotropic離子屬性如何影響肌球蛋白空間構象變化；同時，建立乳化過程中離子屬性、肌球蛋白空間構象及構象重排驅動力三者之間的關系；不僅如此，為了更好地描述蛋白質如何變化，可以利用分子模擬等手段實時表征Chaotropic離子驅動肌球蛋白動態變化的過程，可視化Chaotropic離子誘導肌球蛋白重組裝的具體方式，深入了解離子與蛋白質相互作用的機理。

傳統乳化理論并沒有涉及特殊的離子（如L-組氨酸），因此在肉糜中引入新型離子時，明確該條件下蛋白質的乳化機理尤為重要。因此，可以通過改變Chaotropic離子種類和濃度調控肌球蛋白在脂肪球表面的吸附活動，研究Chaotropic離子種類和濃度對肌球蛋白界面吸附動力學、界面擴張流變性質及乳化穩定性等的影響，從而解析Chaotropic離子誘導肌球蛋白重組影響其在脂肪球表面吸附特性轉變的機理，并建立離子驅動肌球蛋白界面構象轉變與肌球蛋白界面吸附動力學、界面共組裝模式的相互關系，深入了解界面蛋白膜形成機理，完善減鹽模式下的乳化理論。

如何在保障肉制品品質及色、香、味的基礎上降低鹽含量是肉品科學領域需要解決的關鍵問題之一，雖然L-組氨酸、L-精氨酸等Chaotropic離子與肌球蛋白的相互作用可以為解決這一問題提供新思路，然而，“鹽離子-蛋白質構象-蛋白質吸附行為-蛋白質乳化特性”之間的相互關系及其相互影響機理仍需要繼續探索。