雙丹明目膠囊對糖尿病大鼠模型視網膜組織結構改變的影響

彭俊，潘坤，劉崢嶸，秦裕輝，彭清華

糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）中最常見和嚴重的微血管并發癥，是導致DM患者視力下降的主要原因，若不及時治療，可造成不可逆的視功能的損害。秦裕輝教授認為，糖尿病視網膜病變的主要病機為肝腎虧虛、脈絡瘀阻，在長期臨床實踐的基礎上，創制了用于治療DR的雙丹明目膠囊。前期研究表明，雙丹明目膠囊能有效降低DR大鼠血糖和糖化血紅蛋白含量，降低血小板黏附率，改善血液流變性，促進血液循環[1-3]。本實驗觀察了雙丹明目膠囊對糖尿病大鼠視網膜組織結構改變的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗動物取健康，無眼部疾患，1個月齡SD大鼠 40 只，體質量 200～250 g，SPF 級，遠交系，由北京維通利華實驗動物有限公司提供。實驗前檢查雙眼眼部情況無異常，排除全身病變。動物置于18～20℃，相對濕度60%～70%，通風干燥的SPF動物實驗室，予以經嚴格消毒的實驗鼠生長顆粒料及Ⅲ級清潔飲用水飼養，每隔2 d清洗消毒籠具、飲水器具。

實驗藥品雙丹明目膠囊（女貞子、旱蓮草、山茱萸、山藥、茯苓、澤瀉、牡丹皮、丹參、三七、菝葜、牛膝等），由湖南省中醫藥研究院中藥研究所提供，批號：國藥準字Z20080062。羥苯磺酸鈣膠囊（多貝斯），寧夏康亞藥業有限公司，250mg/粒，批號：國藥準字H20030809。重組人血管內皮抑制素注射液（恩度），煙臺麥得津生物工程股份有限公司，15 mg/3 ml，批號：國藥準字S20050088。

實驗試劑血管內皮生長因子-a（vascular endothelial growth factor，VEGF-a）、VEGF-b、VEGF-c、胎肝激酶-1（fetal liver kinase-1，Flk-1），武漢博士德生物技術有限公司；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ），Sigma公司；戊巴比妥鈉，上海化學試劑分裝廠；蘇木精-伊紅，北京鼎國生物公司；4%多聚甲醛、1%餓酸、丙酮、Epon812環氧樹脂、醋酸鈾、檸檬酸鉛、醋酸異戊脂，湖南福滋堂生物公司；4%多聚甲醛，湖南中醫藥大學病理實驗室提供；Harris蘇木素、伊紅、3%過氧乙酸，北京中杉金橋生物技術公司提供。

實驗器材JY3002型電子天平，上海精密科學儀器有限公司；HHS-2電子恒溫不銹鋼水浴鍋：上海南陽儀器有限公司；LEICA DM LB2型顯微照相系統，德國LEICA公司；Shandon325型石蠟切片機，英國Shandon公司；DNP-9162型電熱恒溫培養箱，上海精宏實驗設備有限公司；Motic B5顯微攝像系統，麥克奧迪實業集團公司；LEICA顯微鏡，德國LEICA公司；JSM-1200透射電鏡，日本JEOL公司；雙目顯微鏡，德國Motic公司；雙目顯微照相機，德國Motic公司；RM2235輪轉石蠟切片機，德國徠卡公司；Motic 6.0數碼醫學圖像分析系統，深圳市深沅恒科技有限公司。

1.2 實驗方法

分組動物購回常規飼養1周后，采用隨機數字法將40只大鼠分為4組，每組10只大鼠20只眼。A組：空白組（正常組）；B組：模型對照組；C組：雙丹明目組；D組：陽性對照組。

造模除A組外的30只大鼠進行造模，造模前大鼠禁食10 h，自由飲水。STZ 50mg/kg的劑量一次性大鼠尾靜脈注射。A組鼠尾靜脈注射等量生理鹽水。72 h后取尾靜脈血，強生血糖測試儀測血糖；尿糖試紙定性測尿糖。空腹血糖濃度＞16.7 mmol/L、尿糖在+++以上者，即為糖尿病大鼠。造模后觀察1周，穩定者為造模成功，然后開始計算病程。造模后無大鼠死亡，2只大鼠血糖值偏低，進行第2次尾靜脈注射后達標。

給藥方法各組動物自造模后1周開始連續灌胃，用藥4周后，處死一半動物（各5只大鼠），其余動物繼續灌胃用藥4周，共8周，再處死。各組大鼠均不限飲食，每日更換墊料1次，按時通風，保持環境安靜。（1）空白組、模型組：以生理鹽水10 ml/kg灌胃。（2）雙丹明目膠囊組：使用雙丹明目膠囊溶液灌胃，劑量12.5 ml/kg。（3）陽性對照組：用羥苯磺酸鈣溶液灌胃+重組人血管內皮抑制素玻璃體內注射[2]，羥苯磺酸鈣灌胃1次/d，重組人血管內皮抑制素5g/L，造模后第10天開始玻璃體注射，1次/10 d。

取材2%戊巴比妥鈉過量麻醉后斷頭法處死動物，即刻摘除眼球以10%的福爾馬林固定24 h，去除眼前節，分離出視網膜組織，流水沖洗8 h，經梯度酒精脫水后，行浸蠟、包埋、切片（厚度 4 μm）。

視網膜組織形態的光鏡觀察HE染色后，在光學顯微鏡下觀察HE染色標本視網膜各層結構的形態學變化。

視網膜組織形態的電鏡觀察部分標本 （材料小于1 mm3）經2.5%戊二醛前固定，清洗，1%餓酸4℃下固定3 h，梯級乙醇脫水，Epon812環氧樹脂與丙酮溶液浸透30 min，Epon812環氧樹脂包埋，半薄切片光鏡觀察定位后做超薄切片，經檸檬酸鉛和醋酸鈾雙重染色后采用JSM-1200透射電鏡觀察。

2 結果

2.1 光鏡下觀察各組大鼠視網膜結構

成模后用藥第4周：空白組，視網膜結構層次清晰，視錐視桿細胞排列整齊，無細胞水腫、無壞死、無血管增生（圖1A）。模型組，視網膜組織水腫明顯，毛細血管壁增厚，內皮細胞增生，纖維組織增生明顯（圖1B）。雙丹明目組，視網膜組織輕度水腫，結構層次清晰，部分毛細血管內皮細胞輕度增生（圖1C）。陽性對照組，視網膜組織輕度水腫，結構層次清晰，毛細血管內皮細胞增生明顯（圖1D）。

成模后用藥第8周：空白組，視網膜結構層次清晰，視細胞各層結構排列有序，形態規則，無細胞水腫、無壞死、無血管增生等（圖2A）。模型組，視網膜組織水腫明顯，排列疏松，形態欠規則，毛細血管壁增厚，內皮細胞增生，纖維組織增生明顯（圖2B）。雙丹明目組，視網膜結構層次基本清晰，組織稍有水腫，排列較疏松，形態較規則（圖2C）。陽性對照組，視網膜結構層次較清晰，組織水腫比模型組水腫明顯減輕，排列較疏松，形態尚規則（圖2D）。

圖1 造模成功后用藥第4周各組大鼠視網膜組織HE染色像（×400）。1A.空白組，視網膜結構層次清晰，視錐視桿細胞排列整齊，無細胞水腫、無壞死、無血管增生；1B.模型組，視網膜組織水腫明顯，毛細血管壁增厚，內皮細胞增生，纖維組織增生明顯；1C.雙丹明目組，視網膜組織輕度水腫，結構層次清晰，部分毛細血管內皮細胞輕度增生；1D.陽性對照組，視網膜組織輕度水腫，結構層次清晰，毛細血管內皮細胞增生明顯

圖2 造模成功后用藥第8周各組大鼠視網膜組織HE染色像（×400）。2A.空白組，視網膜結構層次清晰，視細胞各層結構排列有序，形態規則，無細胞水腫、無壞死、無血管增生等；2B.模型組，視網膜組織水腫明顯，排列疏松，形態欠規則，毛細血管壁增厚，內皮細胞增生，纖維組織增生明顯；2C.雙丹明目組，視網膜結構層次基本清晰，組織稍有水腫，排列較疏松，形態較規則；2D.陽性對照組，視網膜結構層次較清晰，組織水腫比模型組水腫明顯減輕，排列較疏松，形態尚規則

2.2 電鏡觀察各組大鼠視網膜超微結構

成模后用藥第8周透射電鏡下觀察視網膜超微組織結構：空白組，視網膜內皮細胞形態正常，呈梭形，細胞間有較好的連接裝置，視網膜毛細血管腔壁完整，基底膜連續、未見增厚（圖3A）。模型組，視網膜毛細血管內皮細胞明顯腫脹，胞體變圓，突向管腔，線粒體腫脹，空泡化，基底膜增厚，部分增厚較明顯（圖3B）。雙丹明目組，視網膜組織結構較完整，視網膜毛細血管基底膜稍增厚，可見周細胞輕度水腫，線粒體腫脹，少數出現嵴消失及結構紊亂，血管內皮細胞未見明顯改變（圖3C）。陽性對照組，組織結構較完整，視網膜毛細血管病變較輕，毛細血管腔壁較光整，基底膜未見明顯增厚，部分內皮細胞輕度增生，少數周細胞出現水腫，線粒體輕度腫脹，結構稍欠清（圖 3D）。

圖3 造模成功后用藥第8周各組大鼠視網膜組織透射電鏡像。3A.空白組，視網膜內皮細胞形態正常，呈梭形，細胞間有較好的鏈接裝置，視網膜毛細血管腔壁完整，基底膜連續、未見增厚；3B.模型組，視網膜毛細血管內皮細胞明顯腫脹，胞體變圓，突向管腔，線粒體腫脹，空泡化，基底膜增厚，部分增厚較明顯；3C.雙丹明目組，視網膜組織結構較完整，視網膜毛細血管基底膜稍增厚，可見周細胞輕度水腫，線粒體腫脹，少數出現嵴消失及結構紊亂，血管內皮細胞未見明顯改變；3D.陽性對照組，組織結構較完整，視網膜毛細血管病變較輕，毛細血管腔壁較光整，基底膜未見明顯增厚，部分內皮細胞輕度增生，少數周細胞出現水腫，線粒體輕度腫脹，結構稍欠清

3 討論

3.1 中醫對糖尿病視網膜病變的認識

中醫稱糖尿病視網膜病變為“消渴內障”[4]，根據患眼視覺變化及視力下降情況，將其納入不同的病癥中，如“視瞻昏渺”“云霧移睛”“血灌瞳神”“暴盲”等。對于本病的認識，金代醫家張子和在《儒門事親》中指出：“消渴者，耗亂精神，過為其度，而燥熱郁盛所成也……可變為雀目或內障”，認為燥熱傷陰為其主要病機；明代趙獻可認為“治消之法無分上中下，先治腎為急，惟六味八味及加減八味丸隨證而服，降其心火滋其腎水則渴自止也”。明代王肯堂所著《證治準繩》亦云：“三消之久，精氣虧虛，則目無所見”，認為本病為精血虧虛、目失所養而成。其后歷代醫家多在此基礎上加以研討發揮，多數認為消渴病日久，精虧液少，不能上承目絡，目睛失養；或肝腎陰虛日甚，陰虛陽亢，虛火上炎，灼傷目絡，而致視物模糊，甚至失明，概言之：陰精虧虛為其主要病機。現代醫家借助眼底檢查、眼底血管造影等手段，并從血流變、微循環、血生化等方面對本病作了科學的研究，發現“血瘀”在其發病機理中具有重要作用，因此，導師秦裕輝教授認為本病病因病機為：腎虛是根、陰虛為本、血瘀為標，概言之“腎虛血瘀”為其主要病機。“虛”為氣血陰陽的虛損；“瘀”為瘀血，它貫穿病機演變過程的始終。因虛致瘀，虛瘀夾雜，以虛為本，以瘀為標，血瘀又是誘發和加快本病發展的病理基礎。故治療DR應該以“滋腎活血”為基本法則。

基于這一法則，秦裕輝教授創制了雙丹明目膠囊（國藥準字Z20080062），開發出國內第一個專治糖尿病視網膜病變的中藥新藥，填補了國內空白。該藥由女貞子、旱蓮草、山茱萸、山藥、茯苓、澤瀉、牡丹皮、丹參、三七、菝葜、牛膝等藥物組成。方中女貞子、旱蓮草滋補肝腎為君藥；山茱萸、山藥補腎養肝、健脾固精，丹參、三七養血活血、化瘀通絡共為臣藥；牡丹皮、澤瀉、茯苓、菝葜清肝瀉火、除濕利水為佐藥；牛膝味苦酸、性平，歸肝、腎經，功能活血逐瘀、強筋壯骨且性善下行，可防血氣上逆，為使藥。諸藥合用共奏益腎養肝、活血明目之功，主治肝腎陰虛、瘀血阻絡所致的糖尿病視網膜病變。多中心臨床試驗取得較好的療效[5-7]，證實該藥能改善患者眼底病變，促進視力恢復，起到治療糖尿病視網膜病變的作用。在2009年，由廣州中醫藥大學第二附屬醫院、北京中醫藥大學東直門醫院、南京中醫藥大學附屬醫院、湖南中醫藥大學第一附屬醫院聯合臨床應用中，用雙丹明目膠囊與羥苯磺酸鈣（導升明）作對照，發現治療后患者眼科檢查中的視力明顯提高。在治療8周、16周后的眼科檢查總分及微血管瘤計分，雙丹明目膠囊療效優于導升明組，治療16周后視力檢查計分優于導升明組，疾病顯效率、總有效率高于導升明組；而不良反應率低于導升明組[7]。我們的前期藥理研究[1--3]也發現，雙丹明目膠囊（原名降糖明目膠囊）聯合降糖藥物能大幅度地促進其降糖效果，單用也能降低血小板黏附率，改善血液流變性，有促進血液循環作用。

3.2 雙丹明目膠囊對糖尿病大鼠模型視網膜組織結構的影響

本研究通過建立糖尿病大鼠模型，觀察雙丹明目膠囊對糖尿病大鼠模型視網膜病變的干預作用，光鏡下對其視網膜病理組織學觀察發現：雙丹明目組的大鼠視網膜組織形態和超微組織結構改變較模型組明顯好轉，其結構層次清晰，僅組織輕度水腫，部分毛細血管內皮細胞輕度增生；而模型組大鼠視網膜組織水腫明顯，毛細血管壁增厚，內皮細胞增生，纖維組織增生明顯。電鏡下觀察視網膜的超微結構發現：模型組大鼠視網膜毛細血管病變明顯，其基底膜增厚，部分增厚較明顯，內皮細胞增生，有微絨毛樣突起，并向管腔突出，管腔狹窄，周細胞水腫、退變甚至消失，部分線粒體可見空泡化；神經細胞病變更明顯，線粒體腫脹顯著，部分空泡化，染色質溶解，嵴間隙擴張甚至消失，視細胞外節膜盤甚至有斷裂、溶解。雙丹明目膠囊治療8周后，大鼠視網膜毛細血管病變輕微，視網膜毛細血管腔壁較光整，基底膜未見增厚，僅少數毛細血管周細胞水腫，線粒體輕度腫脹，結構稍欠清，部分內皮細胞輕度增生。說明雙丹明目膠囊能明顯改善糖尿病大鼠模型視網膜組織形態和超微組織結構，能改善DR大鼠視網膜血管微結構，抑制新生血管的增生。