兔眼前部缺血性視神經病變動物模型的制備

郭輝 ，田紫煜 ，王影 ，劉紹燕 ，李淑敏 ，安榮榮 ，苑文佳 ，孟言 ，白鵬

為研究前部缺血性視神經病變 （anterior ischemic optic neuropathy，AION）的發病機制，曾建立了許多該疾病的動物模型，其中光動力法制備的大鼠AION模型在國內應用最普遍[1]。兔形目動物由于體型較大，性情溫順，更適用于清醒狀態下的針刺實驗研究，故最常被針刺研究所采用。但文獻未見以兔眼制作該模型的報道，而兔的解剖結構及其對光敏劑的代謝均與大鼠有一定差異，可能產生不同強度的光動力效應。為此，本研究通過光動力法，對兔眼制作AION模型進行了小規模的探索，亦獲得了相對適用于兔眼的具體激光參數，期望能成功制備出兔眼AION動物模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

新西蘭大耳白兔12只，普通級，體重1.8～2.5kg，雌性。由北京海淀區興隆實驗動物養殖場提供，許可證號：SCXK（京）2011-0006。所有兔散瞳后經裂隙燈及直接眼底鏡檢查無眼部疾病。

1.2 試劑及儀器

復方托吡卡胺滴眼液（參天制藥（中國）有限公司）、孟加拉玫瑰紅（90%純度）（美國Sigma公司）、20%熒光素鈉注射液 （廣州白云山明興制藥有限公司）、4%多聚甲醛（北京優尼康生物科技有限公司）、蘇木素染液 （北京中杉金橋生物技術有限公司）、伊紅染液（北京中杉金橋生物技術有限公司）、裂隙燈（美國Lumenis公司）、Novus Varia固體多波長眼底激光系統（美國Lumenis公司）、眼底熒光血管造影機（德國heidelberg公司）、90 D前置鏡（美國Ocular公司）。

1.3 模型制備

所有兔子均在 12 h明 （06:00-18:00）/12 h暗（19:00-5:00），溫度在 20～25℃，濕度在 40～70%，背景噪音＜60 dB的環境中喂養。兔子在動物房適應性飼養3 d后，將兔子稱重、編號，在兔子右后肢肌肉注射鹽酸氯胺酮注射液（40 mg/kg）及鹽酸塞拉嗪注射液（5 mg/kg）配制成的水溶液麻醉后，以右眼為實驗眼，復方托吡卡胺滴眼液充分散瞳后，經耳緣靜脈注入孟加拉玫瑰紅 （Rose Bengal，RB）2.5 mmol/(mL·kg)，立即固定于裂隙燈前，右眼加置90 D前置鏡，左眼用黑色不透光眼罩遮蓋。確定視盤位置后，用532 nm綠光、功率75 mW、直徑1000 μm光斑照射實驗眼視盤中上2/3區域60 s，模型制備完畢[2]。

1.4 眼底鏡及FFA檢查

造模結束1 d后，在兔子腹腔注射10%水合氯醛（3 ml/kg）進行麻醉，右眼滴入復方托吡卡胺滴眼液充分散瞳后，立即將兔子固定于裂隙燈前，對側眼用黑色不透光眼罩遮蓋，兔子實驗眼加置90 D前置鏡，觀察其眼底視盤。觀察完畢后經耳緣靜脈注射20%熒光素鈉注射液1 ml/kg，立即行FFA檢查。攝取視野為30度，獲取視盤及其周圍區域圖像，觀察視盤及視網膜血管充盈過程的動態變化。

1.5 HE染色

造模后第2 d，10%水合氯醛，7.5 ml/kg，腹腔麻醉新西蘭大耳兔。以呼吸均勻、用力鉗夾兔腿無肌肉收縮為度。用直齒鑷夾起穹窿結膜，再用小號彎剪剪開結膜并探入，將彎剪背弓面朝向眼球，沿同一方向360°剪開球結膜、球筋膜，遇眼外肌時直接剪斷，避開大血管，依次剪斷下、內、上、外四條眼外肌，向下深探，剪斷視神經，取出眼球。耳緣靜脈推注空氣約30 ml，處死動物。對眼球及視神經組織進行4%多聚甲醛包埋固定；室溫下，50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇依次各浸泡1 h。組織梯度脫水，石蠟包埋。包埋時視神經長軸的方向與包埋盒長軸的方向一致，用石蠟切片機沿視神經的長軸進行連續切片，厚度為4 μm。HE染色，用光學顯微鏡觀察形態學變化，并以400×倍率攝取距視盤邊緣2個視野窗 （約2×265 μm=530 μm）處圖像。

2 實驗結果

2.1 眼底鏡檢查

造模后1 d，新西蘭大耳兔眼底鏡觀察可見實驗眼（右眼）視盤上半水腫，邊界不清。空白對照眼（左眼）視盤邊界清晰，無異常變化。

2.2 FFA檢查

由圖1可以看出造模后1 d，造影早期可見兔子視盤上方低熒光，中、晚期高熒光，這與AION患者臨床表現相似，說明造模成功[2]（圖1）。

2.3 視網膜組織形態結構病理觀察

正常組視網膜各層結構完整，視神經組織內細胞形態正常，排列整齊，神經節細胞無脫落，排列緊密，染色均勻（圖2A）。模型組神經節細胞層出現增生現象，且排列十分紊亂，內核層明顯變薄，細胞數目明顯減少（圖2B）。

3 討論

目前對AION動物模型誘導的方法的研究還處于早期階段，尚未建立標準化的造模技術。1996年，申維勇等試用手術方法制成脈絡膜缺血及AION模型[3]。雖脈絡膜缺血與前部視神經缺血時常并見，但對科研來說未免欠缺嚴謹性，故該方法未能推廣。20世紀80年代，國外學者應用光動力法成功建立動物中樞神經系統的缺血模型、視網膜缺血模型，2003年，Bernstein等[4]報道應用此方法成功制備AION大鼠模型，取得了較為理想的效果。Wang等[5-8]在國內首先利用光動力方法成功誘導出AION的大鼠眼模型。他們在SD大鼠尾靜脈注入血卟啉衍生物(hematoporphyrinderivative，HPD)10 mg， 避光 2 h 后在Volk 78 D前置鏡下照射視盤中上2/3面積，采用波長為645 nm、能量為80 mW的氪紅激光持續照射120 s，此類模型的眼底、FFA、電生理以及病理學表現均與AION的臨床過程相似，因此認為是較為理想的造模方法。

從光敏劑的選擇上來說，目前應用光動力學方法制備AION動物模型時采用的光敏劑主要是孟加拉玫瑰紅 (Rose Bengal，RB)[9]。國內也有學者應用HPD或維替泊芬[5-8]。RB是一種碘化熒光素衍生物，其誘導單線態氧的的作用十分強大，目前已經明確其能導致血栓形成。RB在體內的代謝過程符合一級代謝動力學特征，即在靜脈注射后血液濃度會迅速下降，因此激光照射誘導模型過程需要在RB注射開始后1 min內完成[9]。本次實驗在兔子耳緣靜脈注入RB后1 min內完成激光發射，并將照射時間確定在60 s，以確保達到最佳的光化學反應效果。RB的最大激發光波長為540 nm，因此實驗過程中選擇了與該波長十分接近的532 nm綠光進行激發，光斑的大小取決于家兔視盤的直徑，故選擇光斑直徑大小為 1000 μm。

激光照射的位置選擇在兔子視盤上2/3區域進行照射，更接近于本病臨床上視野的象限性缺損。本課題組從前人的研究中汲取經驗，并根據所具備的實驗條件及實驗者操作能力，通過孟加拉玫瑰紅光動力法，成功制備出AION兔眼模型。造模后，通過眼底鏡及FFA檢查觀察視盤情況、HE染色觀察兔眼組織病理變化證實了模型的可靠性。我們深知，對于一個新的理想的動物模型，還有大量的工作需要完善，比如視覺誘發電位（VEP）等功能學指標的檢測與評估、造模后視盤及視神經血管的動態變化過程等等，這將是我們下一步工作。

綜上所述，選擇合適光敏劑的類型、劑量及與之相符合的激光類型、激光參數、激光照射時間等是成功制備AION動物模型的基礎條件。孟加拉玫瑰紅誘導下激光照射法可以作為兔眼AION模型制備方法。但是由于實驗條件的限制，未能進一步對激光參數、激光照射時間等變量進行研究。

圖1 AION造模家兔眼底熒光血管造影圖.1A眼底熒光血管造影早期：黃色箭頭示視盤上方低熒光；1B眼底熒光血管造影中期：黃色箭頭示視盤上方熒光增強；1C眼底熒光血管造影晚期：黃色箭頭示視盤上方高熒光.

圖2 兩組兔視網膜組織形態結構圖（HE染色，×400）。2A 正常組；2B AION模型組，黃色箭頭示神經節細胞層增生，黑色箭頭示神經節細胞數目減少，綠色箭頭示內核層不同程度變薄