輪狀病毒感染后先天性免疫RLRs通路部分關(guān)鍵因子Q-PCR檢測方法建立

王苗苗，劉陽陽，聞曉波，冉旭華

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

病原體侵入動物體內(nèi)，在其復(fù)制感染過程中，動物機體中存在多種模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs），來特異識別病原微生物的保守度高的病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patter，PAMPs），主要包括位于細胞表面的膜結(jié)合型Toll樣受體（Toll like receptors，TLRs）、位于細胞膜的C凝集素受體（C-Lectin receptors，CLRs）、位于細胞質(zhì)的維甲酸誘導(dǎo)基因I樣受體（retinoic acid-inducible gene I（RIG-I）-like receptors，RLRs）等[1-2]，其中維甲酸誘導(dǎo)基因I樣受體是識別病毒dsRNA的細胞質(zhì)傳感器[3-4]。迄今為止，已經(jīng)確定了黑色素瘤分化相關(guān)基因5（melanoma differentiation associated gene5， MDA5）、維甲酸誘導(dǎo)基因蛋白Ⅰ（retinoic acid-inducible gene I，RIG-I）、遺傳學(xué)和生理實驗室蛋白2（laboratory of genetics and physiology 2，LGP2）3個RLRs成員[5]。MDA5和RIG-I具有相似的結(jié)構(gòu)，含有兩個N末端caspase活化和募集結(jié)構(gòu)域（CARD），中間區(qū)段的DExD/H框RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域和C末端調(diào)節(jié)域（CTD）[6]。RIG-I的CARD結(jié)構(gòu)域能夠與線粒體抗病毒信號轉(zhuǎn)接蛋白（mitoehondrial antiviral signaling protein，MAVS）相互作用以激活TRAF3、TBK1/IKK-i級聯(lián)反應(yīng)，進而磷酸化活化干擾素調(diào)節(jié)因子3（Interferon regulatory Factor 3，IRF3）[7]，誘導(dǎo)I型干擾素分泌，從而激活宿主先天性免疫應(yīng)答，對抗病毒感染。IRF3和IRF7是調(diào)節(jié)IFN和干擾素刺激基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)因子，在I型IFN的表達和分泌上均發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。因此，機體被RV感染后，病毒主要被RLRs受體所識別從而引發(fā)宿主免疫應(yīng)答[8]。

輪狀病毒（Rotavirus，RV）為非囊膜結(jié)構(gòu)的正二十面體病毒，由包含11個節(jié)段的基因組的線性雙鏈RNA組成[9]。該病毒是引起5歲以下嬰幼兒嚴(yán)重腹瀉的主要病原體之一[10]，發(fā)病率高達30%～50%[11]，每年引起約21.5萬人死亡[12]，目前尚無特效治療藥，疫苗是重要的預(yù)防方式之一。以改良的“琴納原理”研制的部分減毒RV單價或重配人用疫苗在臨床試驗中免疫效果卻不理想[13-14]，推測可能與宿主先天性免疫應(yīng)答抑制有關(guān)。為監(jiān)測RV感染后宿主RLRs免疫通路激活情況，本研究以牛RV UK株為研究對象，建立Q-PCR方法檢測相關(guān)因子轉(zhuǎn)錄水平動態(tài)變化情況。本試驗建立的檢測方法具有操作簡便、成本較低、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點。通過探討UK株RV對RLRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路部分關(guān)鍵因子的影響，為從mRNA水平上研究其與宿主先天性免疫功能關(guān)系提供簡便方法，也為研究現(xiàn)有疫苗免疫效果不理想的原因奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒、細胞及試劑 牛RV UK株、人結(jié)腸腺癌細胞Caco-2由本實驗室保存；DMEM培養(yǎng)基購自Life公司；胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司；EDTA-胰酶購于北京索來寶科技有限公司；TRIzol購自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自ThermFisher Scientific公司；SYBR?Premix Ex TaqⅡ購自Takara公司。

1.2 引物設(shè)計 參考NCBI GenBank上收錄的牛RV UK株VP6、人IRF3、人IRF7、RIG-I、MDA5基因序列，運用DNASTAR和Oligo 7軟件設(shè)計特異性引物檢測各目的基因，引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。引物序列如表1所示。

表1 目的基因?qū)崟r定量PCR引物Table 1The primer of real time PCR for target genes

1.3 RV UK株感染Caco- 2細胞 取500 μL實驗室保存的UK株RV病毒液（MOI=2），加入1 μL胰酶（2.5 μg/μL）37℃孵育30 min，活化病毒。然后接種到Caco-2（人結(jié)腸腺癌細胞）細胞中，37℃培養(yǎng)箱放置1 h，期間每隔20 min晃動培養(yǎng)瓶以利于病毒更好吸附于細胞上；棄去病毒液，用無血清DMEM培養(yǎng)基清洗2次以去除未吸附上的病毒；加入含有0.5 μg/mL胰蛋白酶的DMEM培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)6、12、24 h后收集細胞。

1.4 RNA的提取 采用TRIzol法提取感染細胞中的總RNA，具體操作按照說明書進行。最終用30～50 μL無核酶水溶解總RNA，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 反轉(zhuǎn)錄 取3 μL RNA，1 μL Random Hexamer Primer，8 μL無核酶水于PCR管中混勻，65℃孵育5 min，迅速置于冰上冷卻；再加入4 μL 5×buffer，2 μL dNTP（10 mmol/L），1 μL RevertAid RT，1μL RiboLock RNaseInhibitor，42℃2 h，70℃10 min，終止反應(yīng)，得到cDNA。

1.6 實時定量PCR 以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，PCR擴增UK株VP6、人IRF3、IRF7、RIG-I、MDA5。優(yōu)化后反應(yīng)體系為20 μL：2×SYBR Premix Ex TaqⅡ10 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，無核酶水補足20 μL。以感染RU UK株后6 h樣品組為相對對照組，每組設(shè)置3個重復(fù)。優(yōu)化后擴增程序為：95℃3 min；95℃10 s，60℃30 s，40個循環(huán)；65～95℃獲得溶解曲線。

1.7 數(shù)據(jù)分析 運用SPSS 18.0軟件，由2-△△Cq法計算，采用t檢驗法統(tǒng)計分析感染RV KU株的Caco-2細胞VP6、IRF3、IRF7、RIG-I、MDA5基因轉(zhuǎn)錄水平的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 RV感染后在細胞中復(fù)制能力檢測UK株RV感染Caco-2細胞后6 h、12 h、24 h，收集細胞，提取病毒總RNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA，采用特異性引物進行Q-PCR，檢測UK VP6基因轉(zhuǎn)錄水平變化，圖1為VP6基因?qū)崟r定量PCR擴增曲線和溫度溶解曲線圖，圖2為VP6基因轉(zhuǎn)錄水平隨時間變化情況。由所得數(shù)據(jù)分析可知，隨感染時間延長，VP6基因轉(zhuǎn)錄水平逐漸上升，表明UK株RV病毒在Caco-2細胞中不斷復(fù)制擴增。

圖1 VP6實時定量PCR擴增曲線及溫度溶解曲線Fig.1The Amplification and melt curve of VP6 of Real-time PCR

圖 2VP6平均相對含量變化Fig.2The average relative content of UK rotavirus VP6

2.2 RLRs免疫通路關(guān)鍵因子轉(zhuǎn)錄水平監(jiān)測UK株RV感染Caco-2細胞后6 h、12 h、24 h，收集細胞，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA，采用特異性引物進行Q-PCR，檢測RIG-I、MDA5、IRF3、IRF7基因轉(zhuǎn)錄水平變化，圖3為各基因?qū)崟r定量PCR擴增曲線及溶解曲線圖，圖4為各基因轉(zhuǎn)錄水平隨時間變化情況。由數(shù)據(jù)分析可知，在感染6～24 h后，IRF3和IRF7基因轉(zhuǎn)錄水平顯著上升；感染后6～12 h，RIG-I和MDA5基因轉(zhuǎn)錄水平明顯上升，12～24 h則變化不明顯。

3 討論

輪狀病毒為人獸共患的病原體，會引起嬰幼兒和多種幼齡動物的腸道疾病，危害嚴(yán)重，但RV導(dǎo)致機體腹瀉的具體機制尚未清楚，因此開發(fā)切實有效的疫苗來預(yù)防此病是當(dāng)前首要任務(wù)。當(dāng)前世界上有Merck公司開發(fā)的五價人-牛重配疫苗RotaTeq?目前在非洲、中美洲和亞洲某些國家等地所進行的臨床試驗數(shù)據(jù)表明：在某些地區(qū)的疫苗效力尚不足50%[15-16]，Rotarix?疫苗也有類似現(xiàn)象[17-18]，且有研究表明，Rotarix?和RotaTeq?可能會增加嬰幼兒腸套疊的風(fēng)險[19]，推測可能與宿主先天性免疫應(yīng)答反應(yīng)有關(guān)。盡管近些年對RV的研究在逐漸增多，但對于RV的發(fā)病機制及其在感染機體后機體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答過程尚不清楚。

圖 3 IRF3、IRF7、RIG-I和MDA5 mRNA實時定量PCR擴增曲線和溶解曲線Fig.3 The Amplification and melt curve of IRF3,IRF7,RIG-I and MDA5 of Real-time PCR

圖 4 IRF3、IRF7、RIG-I和MDA5平均相對含量變化Fig.4 The average relative content of IRF3,IRF7,RIG-I and MDA5

本試驗以UK株RV為研究對象，選用易于其增殖復(fù)制的人結(jié)腸腺癌細胞，其感染人源細胞Caco-2后6～24 h復(fù)制不斷增加，表明其在宿主細胞內(nèi)復(fù)制能力未受到明顯抑制。Mario等[20]將RV野生型毒株UK、SA11-4F、SA11-30-19和NSP1基因缺陷型毒株brvA、SA11-5S、SA11-30-1A分別感染恒河猴腎細胞MA104，發(fā)現(xiàn)野生型和NSP1基因缺陷型在MA104細胞上復(fù)制能力相當(dāng)；而感染猴肺細胞FRhL2和人結(jié)腸細胞Caco-2，發(fā)現(xiàn)野生型RV復(fù)制能力明顯比NSP1基因缺陷型強，表明這幾個毒株感染MA104細胞后可能未激活細胞的免疫應(yīng)答或較弱的免疫應(yīng)答，而感染FRhL2和Caco-2后則可能激活細胞較強的免疫反應(yīng)，該發(fā)現(xiàn)為減毒RV活疫苗的研發(fā)提供思路。RLRs是宿主識別病毒雙鏈RNA的重要細胞質(zhì)模式識別受體，能夠最終促進I型IFN的分泌，激活宿主先天性免疫應(yīng)答，對抗病毒感染。有研究表明RV感染后對RLRs信號通路具有抑制作用[21]。本研究通過建立QPCR方法，監(jiān)測RLRs信號通路關(guān)鍵因子RIG-I、MDA5、IRF3和IRF7在RV感染后各基因轉(zhuǎn)錄水平變化，結(jié)果表明，UK株RV感染后早期（6～12 h）被細胞質(zhì)模式識別受體RLRs所識別，活化下游信號分子，激活宿主先天性免疫應(yīng)答，各關(guān)鍵因子表達量均上調(diào)，之后在感染后12～24 h，MDA5及RIG-I轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有明顯變化，可能由于RV不斷復(fù)制產(chǎn)生的拮抗宿主免疫的蛋白發(fā)揮作用，逃避了RLRs的識別，抑制了宿主免疫應(yīng)答，模式識別受體轉(zhuǎn)錄水平變化不明顯。該方法可為RV感染宿主細胞后監(jiān)測RLRs信號通路激活情況、先天性免疫應(yīng)答情況提供數(shù)據(jù)支持。