副豬嗜血桿菌PCR檢測方法的建立及應用

梁 喬，楊本勇，石 霖，李井春，張 健，趙鳳菊?

（1.遼寧省動物疫病預防控制中心，遼寧 沈陽 110164；2.遼寧省動物醫學研究院，遼寧 沈陽 110164）

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis）是常規豬上呼吸道的共存菌，在特定條件下，能夠引起纖維素性心包炎、腦膜炎、急性敗血癥等疾病[1-2]。該菌主要的感染對象是斷奶前后仔豬和保育豬，具有較高的發病率和死亡率[3-4]。呼吸道疾病的危害性日趨顯著，尤其是引起的多發性漿膜炎、關節炎等危害性疾病嚴重影響養殖業的發展[5]，因此，早期檢測尤為重要，本試驗通過對副豬嗜血桿菌的保守基因infB序列設計引物，建立了該病原菌的PCR檢測方法，為該病的防控和研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 副豬嗜血桿菌由沈陽農業大學惠贈，金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、致病性大腸桿菌、奇異變性桿菌、豬鏈球菌由遼寧省動物疫病預防控制中心保存。

1.1.2 主要試劑DNAzol購自invitrogen公司；EX Taq DNA聚合酶（5 U/μL）、dNTP（2.5 mmol/L)、溴化乙錠、DL 2000 DNA Marker、三羥甲基氨基甲烷-乙酸電泳緩沖液購自寶生物工程（大連）有限公司；犢牛血清購自澳洲Gibico；TSA購自北京奧博星公司；輔酶I（NAD煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）購自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 引物 根據副豬嗜血桿菌infB基因序列設計，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，根據GenBenk公布的國內外副豬嗜血桿菌infB基因的參考序列合成1對引物分別為：DQ781933、EF396317、HM243068、KT740926，引物序列見表1。

表1 infB基因PCR引物Table 1Design of PCR primers for HPS

1.2 方法

1.2.1 DNA模板的制備 取保存的副豬嗜血桿菌菌種接種于加有血清的TSA培養基上，37℃培養18～24 h后，挑選典型菌落，用滅菌生理鹽水制備成0.5麥氏單位的菌懸液，按DNAzol提取試劑說明書進行DNA的提取，將提取的DNA置-20℃備用。

1.2.2 infB基因的PCR反應及條件 采用25 μL反應體系：滅菌去離子水15.375 μL；10×PCR緩沖液 2.5 μL；dNTP Mixture（各 2.5 mmol/L）2 μL；EX Taq DNA聚合酶0.125 μL；上、下游特異性PCR引物各1 μL；DNA 2 μL。反應條件為 ：94℃3 min，94℃30 s，49℃30 s，72℃50 s，35個循環；72℃10 min。

1.2.3 特異性試驗 將副豬嗜血桿菌和金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、致病性大腸桿菌、奇異變性桿菌、豬鏈球菌在優化后的體系和條件下進行PCR擴增，并設立陰性對照。

1.2.4 敏感性試驗 將副豬嗜血桿菌DNA進行10倍倍比稀釋5個梯度后，進行擴增來檢測該方法的敏感性。

1.2.5 臨床應用 用本試驗建立的副豬嗜血桿菌PCR檢測方法對10份臨床樣品進行檢測，同時設立陽性病料對照、無模板陰性對照，并選取6份副豬嗜血桿菌陽性樣品擴增其infB序列，送上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序，并與NCBI基因庫進行序列同源性比較。

2 結果與分析

2.1 副豬嗜血桿菌PCR擴增結果 以副豬嗜血桿菌的DNA為模板，利用本試驗建立的方法進行PCR檢測，結果顯示，PCR可擴增出目的條帶，無模板陰性對照無目的條帶（見圖1）。

圖1 副豬嗜血桿菌PCR擴增結果Fig.1PCR amplification results of Haemophilus accessory swine Haemophilus

圖2 PCR擴增結果及退火溫度的優化Fig.2PCR amplification results and Optimization of annealing temperature

2.2 PCR擴增結果及退火溫度的優化 對PCR退火溫度進行優化，結果顯示，不同退火溫度對擴增結果影響不大，最終選擇49℃作為PCR最佳退火溫度（見圖2）。

2.3 特異性試驗結果 按照優化后的反應體系和反應條件對副豬嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌、奇異變形桿菌、豬鏈球菌及陰性對照進行特異性試驗。結果顯示，均未擴增出條帶，而副豬嗜血桿菌可見清晰的目的條帶（見圖3）。

圖3 特異性試驗結果Fig.3 The specificity test results

2.4 敏感性試驗結果 采用優化后的條件進行擴增，結果顯示，敏感性達到10-6倍稀釋度，最低檢出量分別為18.1×10-6μg/mL（見圖4）。

圖4 敏感性試驗結果Fig.4The sensitivity test results

2.5 部分臨床樣品檢測結果 應用建立的方法對10份臨床樣品疑似病料進行檢測，6份為副豬嗜血桿菌陽性，4份為副豬嗜血桿菌陰性。陽性擴增產物經測序后與GenBank中收錄的副豬嗜血桿菌infB基因參考序列進行比較，結果顯示，6份陽性樣品經測序比對后的基因序列核苷酸同源性為98.2%～99%范圍內，說明該方法能準確地檢測出病料中的副豬嗜血桿菌。

圖5 部分臨床樣品檢測結果Fig.5Test results of some clinical samples

3 討論

本試驗建立的副豬嗜血桿菌PCR檢測方法能夠擴增出與預期片段大小一致的目的基因條帶，且對其他5種細菌均無擴增反應發生，表明建立的PCR方法具有較高的特異性。通過敏感性試驗發現在菌懸液濃度為18.1×10-6μg/mL時，能夠擴增出清晰的目的條帶，說明該方法具有較好的敏感性，通過臨床樣品的檢測，說明該方法能用于檢測臨床病料的檢測。

副豬嗜血桿菌作為一種呼吸道傳染病嚴重危害養豬業，也成為世界范圍內導致保育仔豬死亡的一種典型的細菌性疾病，能夠引起豬的全身性感染，如多發性漿膜炎、關節炎、腦膜炎、支氣管肺炎等[6]。副豬嗜血桿菌病常常與豬繁殖呼吸綜合征、圓環病毒病等免疫抑制性疾病發生混合感染，單純靠臨床癥狀無法確診該病[7]。傳統的細菌分離鑒定存在耗時長、不易于保存等特點[8-10]，本試驗建立的PCR的檢測方法不僅為副豬嗜血桿菌病的診斷提供的技術支撐，也為多發性漿膜炎、傳染性胸膜肺炎等的有效防控提供了理論依據。