單顆粒熒光閃爍現象、機理與應用

陳方圓，蘇 華，王 偉

(南京大學 化學化工學院 生命分析化學國家重點實驗室，江蘇 南京 210023)

單分子檢測技術始于20世紀80年代末，隨著各種顯微技術的發展，人們得以了解單分子水平上的物理與化學過程。1989年，Moerner等[1]在液氦條件下檢測到嵌于對三聯苯晶體中的單個染料分子并五苯的吸收信號，這是首次在單分子水平上開展的實驗研究。隨后幾年，單分子檢測技術由低溫檢測發展到常溫檢測，由最初單分子光譜[2]的測定，到利用近場掃描光學顯微鏡[3]、遠場共聚焦熒光顯微鏡[4]以及全內反射熒光顯微鏡[5]等技術實現單分子熒光成像，并由此發現了許多單分子尺度特有的新現象。例如，1994年Moerner等[6]在低溫條件下，首次發現在固體基質中的單個Terrylene分子會在兩種狀態間切換，并通過改變激光功率證明該現象由光照引起。1996年，Brus等[7]發現單個CdSe量子點的發光在激光的連續照射下并不連續，而是在“亮態”和“暗態”之間隨機、頻繁轉換，表現出顯著的間歇性，并推測其不發光的“暗態”與光致電離過程有關。1997年，Moerner與錢永健等[8]觀察到綠色熒光蛋白(GFP)的突變體T203F和T203Y的單分子熒光強度隨時間波動，是蛋白質分子熒光閃爍現象的最早報道。

圖1 一個CdSe/ZnS量子點熒光發射強度的時間曲線Fig.1 Representative fluorescence emission intensity curve of a single CdSe/ZnS quantum dot

上述單個熒光生色團在連續的激發光照射下間歇性的熒光發射現象稱為熒光閃爍(Fluorescence intermittency,俗稱Photobinking)。圖1顯示了一個CdSe/ZnS量子點的典型熒光閃爍曲線。在穩定光源的持續照射下，其熒光發射會在明暗之間波動：明是分子熒光處于發射態(“On state”)，暗是分子熒光處于非發射態(“Off state”)。每一個狀態持續時間不等，典型時間范圍從毫秒到數分鐘[9-10]。熒光閃爍現象具有以下典型特征：首先是個體之間的不同步性。不同個體的熒光閃爍現象并不同步，因此含有大量生色團個體的宏觀體系由于系綜平均效應無法觀測到這一閃爍現象，而是具有穩定的熒光發射。例如，利用穩態熒光光譜儀對含有大量熒光分子的溶液進行測量時并不能觀察到熒光閃爍。不僅如此，對于粒徑較大且結晶度較差的熒光納米材料，即便在單顆粒水平上測量也不易觀察到熒光閃爍現象。這主要是由于此類材料往往包含較多熒光生色中心。因此，熒光閃爍現象本質上是單個熒光生色中心的特征，而不是單個物理個體的特征。其次，對單個熒光生色團而言，其熒光發射強度的時間曲線具有隨機性、顯著性和頻繁性[11-12]。隨機性主要表現在單一發射態和非發射態的持續時間缺乏明顯規律，往往在毫秒和數分鐘之間隨機分布。盡管對大量事件的統計分析表明其持續時間服從一定的統計規律(如冪律分布)[9]，但單一事件本身無法預測，而且受外界環境的影響規律尚不明確[13]。顯著性表現在兩個狀態之間的發光強度之間存在明顯差別，通常表現為強烈熒光發射和完全無發射兩種狀態之間的切換。這一特征有別于熒光相關光譜分析中由于分子熱運動引起的熒光強度微小波動或漲落。頻繁性表現為在較短的觀測窗口(通常為數分鐘)內狀態切換事件頻繁發生，而非有限的幾次狀態切換。

自發現以來，對熒光閃爍機理的探索在相當程度上提升了人們對分子，特別是半導體光物理過程的認識和理解。盡管目前科學界一般認為這一現象與半導體材料的光致電離和無輻射俄歇過程有關，但許多細節仍有很大爭議[14-15]。不僅如此，對于以熒光量子點作為生物成像探針的應用而言，頻繁出現的暗態不利于定量和空間定位。對于基于大量半導體的光電顯示和轉換器件而言，暗態的存在將光能以熱輻射的形式加以損耗，從而降低了器件效率。然而熒光閃爍現象不僅為超分辨熒光成像技術的發展提供了原始的啟發[16-17]，近年來更為半導體異質結[18]和納米化學[19]等領域帶來了許多新的潛力和機遇。因此，探究熒光閃爍機制具有重要的理論和現實意義。

1 熒光閃爍的光物理機制

1.1 有機熒光分子

相對而言，有機熒光分子的熒光閃爍機制較為明確。1995年，Br?uchle等[20]通過記錄單個有機染料分子(Terrylene)熒光強度的自相關函數獲取其系間竄躍速率(S1～T1，T1～S0)，進而提出分子系間竄躍到三線態(壽命較長)導致產生暗態的觀點。2003年，Orrit等[21]發現羅丹明6G分子的暗態由三線態引起，并通過構建理論模型驗證了三線態作為中間態而導致熒光分子長期不發光的結論，首次發現光誘導電荷轉移也是引起熒光閃爍的原因之一。之后，Ha等[22]發現Trolox(一種水溶性VE類似物)是良好的三線態猝滅劑，能夠有效抑制單分子熒光閃爍現象。

1.2 量子點

Efros等[23]于1997年提出量子點熒光閃爍的off態是由于帶電激子俄歇復合引起。盡管許多細節仍有待闡明和完善，這一觀點的基本框架已被人們普遍接受。當1個不帶電的量子點在光照下被激發將產生電子和空穴(激子)，電子和空穴復合發射出光子，即產生熒光。若量子點帶電(中性顆粒發生電荷分離)，在光激發下又產生1對電子空穴對時，激子和這個多余的電荷相互作用，將發生快速非輻射躍遷俄歇過程。由于俄歇復合速率比輻射復合速率高幾個數量級，所以熒光過程在很大程度上被抑制，量子點則處于非發射態，off態由此產生。直至量子點中這個多余的電荷被中和，量子點在光照下產生激子，電子和空穴復合產生熒光，量子點返回on態。總體上，量子點熒光閃爍過程是光照引起量子點帶電，發生on-off的轉變；而當量子點中的電子被中和后，發生off-on的轉變[24]。

Efros建立的模型為探究熒光閃爍機制奠定了堅實基礎。然而，該模型存在一個與實驗現象不符的問題，即它預測的on/off-time統計分布呈單一指數關系[14]。因此，人們在此模型的基礎上進行了一系列修正，提出了多種模型解釋on態和off態持續時間的概率密度與on/off-time成冪函數的倒數關系的規律，即冪律分布(Power-law distribution)。主要提出了以下模型：①Verberk等[25]構建的多載流子陷阱模型，成功地解釋了power-law統計中off-time的概率分布，但未能解釋on-time的power-law分布。②Shimizu等[26]構建的能級漂移模型，以及在此基礎上，Tang等[27]提出的量子點和捕獲態能級均發生漂移的觀點，這一理論預測到on/off-time的power-law分布的斜率在較長時間為1.5，而在較短時間為0.5，與實際1～2之間分布的規律不符。③Margolin等[28]構建的空間跳動模型，該理論模型預測的on/off-time斜率為1.5，然而實驗結果顯示斜率可在1～2之間變化。而且，此模型中電子有可能再也回不到量子點內部，從而使量子點不再發光，與實驗不符。④Kuno等[29]構建的勢壘波動模型，電子隧穿勢壘的高度和寬度存在波動，在隧穿過程中，局域環境的變化使得on-off和off-on的轉變速率發生變化，而此模型中隧穿速率的6個數量級的變化與實驗不符。

上述模型均是基于熒光閃爍由帶電激子引起的俄歇復合導致，需要長壽命捕獲態，被稱為A型熒光閃爍。但這些模型難以解釋power-law中連續的壽命分布。與A型熒光閃爍相對應，不需要長壽命捕獲態和俄歇復合的模型，稱為B型熒光閃爍[15]。

圖2 B型熒光閃爍的機制示意圖[15]Fig.2 Schematic of Type-B blinking mechanism[15]

B型熒光閃爍中，空穴被壽命約為1 μs的捕獲態捕獲，與導帶電子發生非輻射復合產生off態，電子被激發和復合后，量子點迅速回到中性基態。在這類熒光閃爍過程中，捕獲速率隨時間波動，當捕獲速率遠大于輻射復合速率時，量子點在一段時間處于off態。具體過程為：空穴捕獲速率kt遠小于量子點的輻射復合速率kr，量子點發出熒光，即on態(圖2A)；當kt增大，且大于kr時，會發生on～off的轉換(圖2B)；kt遠大于kr，量子點處于off態(圖2C)；當kt變小，且小于kr時，發生off～on的轉換(圖2D)。

關于B型熒光閃爍，Frantsuzov等[30]提出非輻射復合速率波動模型。量子點中電子在最低的兩個電子能級間躍遷1S(e)～1P(e)，躍遷產生的能量漂移調控空穴的捕獲速率(圖2E)。此模型很好地解釋了連續的壽命分布，但得到的power-law中on和off的指數數值為1.5。Barnes等[31]對此模型進行改進(圖2F)，提出多復合中心模型，成功解釋了在交換配體后，量子點的熒光閃爍得到抑制的現象。

目前，量子點熒光閃爍機制的基本框架已搭建，且上述理論模型能夠解釋大多數實驗結果，但單獨任何一個模型均不能解釋所有的實驗現象和結果。特別是A型熒光閃爍中量子點電離和中性化的機理尚未明確。

2 具有熒光閃爍現象的納米材料

隨著納米科學的發展，人們發現許多種類的納米材料具有優異的熒光性能。單顆粒熒光光譜與成像研究顯示，其中一些納米材料表現出熒光閃爍行為，主要包括半導體量子點、碳納米點、聚合物點和金屬團簇等。由于光致發光機理的不同，另一些常見的熒光納米材料(如上轉換材料、碳納米管等)的熒光閃爍特性則較不明顯。需要指出的是，這些認識并非一成不變，而是有望隨著測量科學和材料學科的進一步發展得到深化和革新。

2.1 半導體量子點

以CdSe為代表的Ⅱ-Ⅵ族量子點以其優異的量子效率和光穩定性，以及成熟的合成方法一直是熒光閃爍研究最重要的模型體系。單顆粒熒光成像揭示的閃爍現象和機制為科學家們合成長時間處于on態的量子點指明了方向[11,32]。有關CdSe量子點熒光閃爍已有許多綜述發表[15,24]。由于Ⅱ-Ⅵ族量子點鎘元素潛在的毒性，以InP為代表的Ⅲ-Ⅴ族無鎘量子點得到了發展。單顆粒熒光成像研究表明，InP同樣具有熒光閃爍現象[33]。2015年，一種新型的量子點——鈣鈦礦量子點(Perovskite)被成功制備[34]。這種量子點除具有Ⅱ-Ⅵ族量子點高量子產率的優點外，還能夠利用簡單鹵素交換實現可見光區發光性質調節，目前已在LED、量子點激光器、太陽能電池等領域展現出應用潛力[35]。最近研究發現，鈣鈦礦量子點同樣存在熒光閃爍行為[36-37]，但亦有研究者發現合成的鈣鈦礦量子點距離較遠時不閃爍，距離靠近時閃爍[38]。

Ⅳ族量子點以硅量子點為代表。硅為間接帶隙半導體，而當硅尺寸減小到4 nm的激子波爾半徑時，量子限域效應使其聲子調控的間接帶隙躍遷被抑制，而直接帶隙躍遷得到增強，呈現出強的熒光[39]。已有研究表明，硅量子點與Ⅱ-Ⅵ和Ⅲ-Ⅴ族量子點類似，同樣具有熒光閃爍行為[40]。

2.2 熒光碳納米點(石墨烯量子點)

自從2004年被首次發現以來，熒光碳納米點以其易于制備、低毒和高熒光穩定性受到廣泛研究[41]。Sun等[42-44]將激光蝕刻法合成的熒光碳納米點進行PEG修飾后，利用共聚焦熒光顯微鏡進行了單顆粒成像，發現其無閃爍現象。然而，Richards等[45]在對合成的熒光碳納米點進行單顆粒成像時，發現熒光碳納米點具有閃爍現象，且on態和off態均存在多種熒光強度值，揭示了其多發光中心的特點，顯著區別于傳統的半導體量子點和鈣鈦礦量子點。石墨烯量子點屬于一類特殊的熒光碳納米點，嚴格意義上講是具有一層或者少數幾層石墨烯結構的熒光碳納米點。Xiao等[46]對石墨烯量子點進行了單顆粒成像并測得了單顆粒光譜，發現了大量顆粒測試時得不到的信息：石墨烯層數越多的顆粒,其熒光越強而壽命越短；石墨烯量子點尺寸分布寬，但具有相同的光譜線寬和發射峰位；石墨烯量子點無閃爍的特征。

2.3 聚合物點

聚合物點是指由∏共軛聚合物組成的熒光納米顆粒。通常認為尺寸大于10 nm的聚合物點不存在閃爍特征，而小尺寸的聚合物點仍存在閃爍。這是由于較大的聚合物點具有多個發光中心引起強度平均化所致[47]。

2.4 金屬納米簇

當金屬的尺寸達1 nm左右時，導體的連續能帶將變成分離能級，即量子限域效應將使金屬納米顆粒表現出熒光特征，稱為熒光金屬簇，目前主要包括銀、金和銅簇。一般認為Ag納米簇不存在熒光閃爍現象，是指其在0.1 ms～1 s的生物學標記窗口中無閃爍[48]。2007年，Dickson等[49]合成了單鏈DNA修飾的Ag納米簇(C12-Agn)，利用Hg燈激發在寬場下觀察到其單納米顆粒的近紅外熒光發射，研究發現647 nm連續波激光器照射下，低功率時C12-Agn未表現出閃爍，而高功率下表現出閃爍(23 000 W/cm2)。金納米簇通常存在長時間的閃爍。Majima等[50-51]以405 nm二極管激光器作為光源，在顯微鏡上原位照射自由基前軀體2-羥基-4′-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮和氯金酸的混合物，發現聚乙酸乙烯酯膜上原位產生了無配體修飾的熒光金納米簇，直徑約1 nm，最大激發波長和最大發射波長分別位于409 nm和490 nm，單納米顆粒成像揭示其存在閃爍特征且長時間處于off態，并利用單顆粒熒光研究了其與氧氣的相互作用。

3 單顆粒熒光閃爍的利與弊

雖然量子點的熒光閃爍制約了其在很多方面的應用，但熒光閃爍并非完全不利，這一現象的利與弊取決于其用處[52-54]。從基礎研究的角度來說，熒光閃爍現象是中性的。量子點作為熒光探針和單光子源時，熒光閃爍現象會帶來負面影響。然而，利用量子點的熒光閃爍可以研究反應活性及電子轉移，而超分辨熒光成像正是利用了量子點熒光閃爍的性質。

3.1 熒光閃爍之弊

近年來，量子點發光設備(QD-LEDs)發展迅猛。顯示器件在經歷了陰極射線管(CRT)的笨重、等離子體面板易燒屏、有機發光二極管(OLED)壽命短的變革后，QD-LEDs展現了獨特的優勢，具有色彩純凈、飽和度高、色域廣、使用壽命長等特性。然而，量子點的熒光閃爍會影響QD-LEDs的發光性能[55]，這是由于量子點的熒光閃爍會降低其熒光量子產率，從而直接降低外部量子效率。熒光閃爍對單分子的光電器件影響尤其大，熒光閃爍的off態持續時間可從秒級到數分鐘甚至更長，甚至可能導致器件長時間不發光。

相比于有機熒光分子，量子點用作生物探針時具有光穩定性好、亮度高等特點。然而，量子點的熒光閃爍會導致生物體系中單分子追蹤的中斷，從而要求特殊、復雜的數據分析方法重建單細胞的軌跡[56-57]。

3.2 熒光閃爍之利

由于光學衍射極限的存在，光學顯微鏡的分辨率受限，在數值孔徑為1.4，入射光波長為550 nm的情況下，水平方向和z軸方向分辨率分別為200 nm和500 nm[58]。因此，普通的光學顯微鏡很難看清細胞結構，所以發展一種高空間分辨率的技術尤為重要。

圖3 STORM超分辨熒光成像的原理[17]Fig.3 Schematic of stochastic optical reconstruction microscopy(STORM)with fluorophores[17]

Betzig、Zhuang等[16-17]于2006年幾乎同時提出了隨機光學重構顯微術(STORM)和光活化定位顯微術(PALM)。這兩種成像技術均是利用熒光漂白和熒光恢復的特性調控活性熒光生色團的密度，通過單分子水平的超定位技術實現超分辨成像，其水平方向和z軸方向分辨率分別能達到20 nm和50 nm。以STORM超分辨熒光成像為例，綠光和紅光分別為激發光和成像光源。通過使用低功率的綠光照射樣品，使少部分熒光分子發熒光，再將這些發光的分子全部猝滅，然后再隨機激活一部分熒光分子。循環往復，直至所有的熒光分子均被猝滅(圖3)。這些每次被激發的分子團相距較遠互不干擾，經過二維高斯擬合能夠精確定位每個熒光分子的中心位置。連續拍攝多張圖片，得到所有熒光分子的中心位置，最后疊加構成完整的圖像。由此可見，熒光閃爍現象不僅啟發了超分辨熒光成像技術的發展，而且構成了一些超分辨技術(如dSTORM)的直接基礎。

Lagerholm等[59]測定了DNA片段間的距離，利用量子點的熒光閃爍精確測定相距很近的量子點的位置，由于每個量子點閃爍行為不同，通過連續拍攝一段錄像，分析比較圖像中每個像素點記錄的熒光在這段時間內的閃爍情況。選取某個量子點進行分析，將此量子點在這段時間內的每次定位進行平均，按此方法對所有量子點進行定位。

Jain等[60]研究了有熒光發生變化的離子交換反應，在交換反應發生時由于瑕疵或摻雜，導致量子點熒光閃爍嚴重，從而可通過熒光閃爍隨反應變化的時間反映中間產物的壽命，所研究的離子交換反應如下：

不同于對多個顆粒的熒光軌跡單獨分析，此項研究則是分析多個顆粒在同一幀的發光情況求得每刻發光的顆粒數(Bright fraction)，從而得到量子點平均閃爍信息。該研究對不同反應方向的Bright fraction隨時間變化進行分析，進而由熒光閃爍現象加劇的時間確定中間態壽命。因為在離子交換過程中，電荷不匹配產生捕獲位點以及交換不完全引入雜質而產生捕獲態，會導致off態變得更加普遍。盡管熒光閃爍具有隨機性，但仍然可以建立量子點熒光閃爍行為與其化學/結構狀態之間的關系。因此，可以利用量子點熒光閃爍行為指示量子點化學/結構的質量。

半導體量子點的熒光閃爍現象本質上是隨機動態的載流子行為在量子效率上的反映。這一行為在引起間歇性的載流子復合過程(即熒光)的同時，可能導致界面上電子或空穴轉移(即光化學反應)的不連續性[61]。基于此，本課題組近期利用表面等離激元共振顯微鏡[62]和熒光顯微鏡[63]分別測量了單個CdS納米顆粒在連續光激發下的催化產氫效率，發現了顯著的光化學間歇特性。這些結果在單顆粒水平上建立了半導體光物理過程與光化學反應之間的內在關聯。

4 總結與展望

本文簡要介紹了單顆粒熒光閃爍的現象、機理與應用等方面的研究進展。熒光閃爍現象具有隨機性、顯著性、頻繁性等典型特征，且其在熒光納米材料中普遍存在。目前，盡管對單顆粒熒光閃爍的光物理機制已有較多認識和理解，但許多細節仍有很大爭議。熒光閃爍尚不能被完全消除，只能在一定程度上加以抑制，如何獲得不閃爍的量子點仍是許多科學家努力的方向。然而，熒光閃爍并非完全有害無益，它不僅為超分辨熒光成像技術的發展提供了原始的啟發，近年來更為半導體異質結、光化學反應和分析傳感等領域帶來了許多新的潛力和機遇。比如，通過利用熒光閃爍的相關動力學規律作為生物化學傳感器的檢測信號，有望發展出可用于單細胞等微納尺度復雜體系的新型單顆粒傳感方法。相信隨著研究的不斷深入，科研工作者們能夠調控熒光閃爍，并利用熒光閃爍特性研究單納米晶更多方面的性質和應用。