N-糖基化蛋白質組樣品富集策略的研究進展

邵文亞，梁 玉，梁 振*，張麗華，張玉奎

(1.中國科學院大連化學物理研究所 中國科學院分離分析化學重點實驗室，遼寧 大連 116023；2.中國科學院大學，北京 100049)

蛋白質的糖基化作為生物體最重要、最常見的蛋白質翻譯后修飾之一，在蛋白質相互作用、分子識別、免疫應答[1]、信號傳導[2]等關鍵生物學過程發揮了重要作用。生物體內糖基化位點以及糖基化水平的異常與多種疾病密切相關，如腫瘤的發生和轉移、神經退行性疾病、代謝相關疾病等[3-4]。目前，已有很多糖蛋白質作為生物標志物或藥物靶標用于臨床上疾病的預警、診斷和治療[5-7]。糖蛋白質組學作為蛋白質組學的重要分支，已經成為蛋白質組學研究中的熱點領域[8]。

糖蛋白質是在蛋白質的特異氨基酸殘基上通過共價鍵方式連接上糖鏈所形成，一般可按糖鏈所連氨基酸殘基以及連接方式的不同將蛋白質糖基化分為以下類型：N-糖基化、O-糖基化、C-糖基化以及糖基化磷脂酰肌醇錨(GPI-anchored)等[9]。其中，N-糖基化是糖鏈還原端的半縮醛羥基通過N-糖苷鍵連接到蛋白質特定氨基酸序列的天冬酰胺殘基(Asparagine，Asn)側鏈酰胺基上所形成，其特定氨基酸序列是指N-X-S/T/C(X為除了脯氨酸以外的任意氨基酸，S 為絲氨酸，T 為蘇氨酸，C 為半胱氨酸)。在糖鏈組成方面，N-連接糖鏈一般由一個三甘露糖-殼二糖的核心五糖結構以及若干糖單元組成，根據糖單元的組成可分為高甘露糖型、復合型和雜合型3類。N-糖鏈可被肽N-糖苷酶F(Peptide N-glycosidase F,PNGase F)高效、特異性的切除，再加上N-糖基化發生于特定的氨基酸序列，因此N-糖基化可以依靠質譜分析和數據庫檢索手段實現大規模位點鑒定，成為目前研究最多的糖基化類型，已有許多規模化的N-糖基化數據庫發布，但其鑒定數量僅占理論預測的5%～10%。主要原因是糖基化雖然是生物體內普遍發生的一種翻譯后修飾，哺乳動物體內糖蛋白質的比例高達50%，但其豐度通常較低，且糖基化蛋白質酶解肽段中僅有2%～5% 為糖基化肽段，另外在質譜中糖肽的離子化效率不高，糖基化蛋白質/肽段往往不易被質譜所鑒定[10-11]。因此，為實現糖基化蛋白質/肽段的深度覆蓋分析，對糖基化蛋白質/肽段進行高選擇性富集對于糖基化蛋白質組學研究具有重要意義。本文對目前N-糖基化蛋白質組樣品富集方法的原理、特點以及最新研究進展進行了綜述。

1 N-糖基化蛋白質組樣品的富集方法

目前，N-糖基化蛋白質組樣品的富集方法根據其富集機理不同，主要分為凝集素親和法、酰肼化學法、親水作用色譜法及硼親和法等。

1.1 凝集素親和法

凝集素作為一類非抗體類糖蛋白質，具有1個或多個功能性結構域，該結構域能夠專一與糖蛋白質/肽連接的聚糖內部或末端某些特定單糖或者寡糖精細結構特異性地可逆結合。因此，凝集素可用以捕獲特定的糖蛋白質或糖肽，之后再通過用特定的單糖競爭結合的方式將其洗脫下來[12-13]。不同的凝集素對不同類型的糖鏈具有特異性的識別能力，可以使用單一凝集素對某特定類型的糖蛋白質/糖肽進行特異性富集，也可使用多種凝集素(Multi-lectin affinity)[14]，或者連續凝集素親和層析(Serial lectin affinity chromatography,SLAC)[15]對樣品中的糖蛋白質/糖肽進行全譜富集。Mann等[16]將凝集素親和法與濾膜輔助樣品預處理技術相結合，使糖蛋白質的富集和酶解同步進行，通過該技術對鼠組織及血漿中的 N-糖基化蛋白質進行分析，共鑒定 6 367 個糖基化位點，對應于 2 352 個糖蛋白質。該課題組[17]進一步將相對定量技術Super-SILAC與上述凝集素富集策略結合，通過對糖基化位點的定量分析，研究了11 種代表乳腺癌不同發展時期的細胞系中分泌蛋白糖基化位點的變化情況，以尋找乳腺癌的疾病標志物。Allmaier等[18]將帶有凝集素的磁性納米顆粒用于木霉菌(Trichoderma atroviride)中糖蛋白質的富集，之后通過凝膠電泳(SDS-PAGE)結合質譜技術，發現木霉菌中存在兩個關鍵的糖蛋白，該研究首次將凝集素富集方法用于真菌類糖蛋白質組學鑒定。

凝集素親和法操作簡單，可在糖蛋白和糖肽水平上實現富集，且能保持糖鏈結構的完整性，對于研究某些含有特定單糖的糖蛋白(如：唾液酸化或核心巖藻糖化的N-糖基化蛋白質)具有一定優勢，這些糖基化在某些病理和生理過程中發揮著重要作用[19-20]。但是，凝集素的親和專一性使大規模的糖基化富集需要同時使用多種凝集素，成本較高，限制了該方法的廣泛應用。

1.2 酰肼化學法

酰肼化學法是將糖蛋白或糖肽糖鏈上的順式鄰二羥基通過高碘酸氧化轉化為醛基，利用醛基與含有酰肼基團的基質材料共價作用，從而實現對糖基化蛋白質/肽段的選擇性富集[21]。具體過程如下：首先是氧化反應，通過高碘酸鹽將糖蛋白/肽上糖鏈中的順式鄰二羥基氧化成醛基；其次是共價偶聯反應，通過生成的醛基與基質材料上的酰肼共價結合形成腙鍵，從而實現對樣品中糖蛋白/糖肽的特異性捕獲；最后是洗脫與酶解，先通過洗脫液將未發生共價結合的蛋白質或肽段從體系中去除，再利用糖苷酶將N-糖基化蛋白質/肽段釋放，進而進行質譜分析。目前，該方法可分為糖蛋白質水平的富集及糖肽水平的富集兩種策略。但由于蛋白質溶解性差，空間位阻大，后續需酶解等因素限制，因此基于酰肼化學的富集方法已逐漸發展為以糖肽水平的富集策略為主[22-23]。該方法于2003年由Aebersold等[24]首次提出并用于人血漿樣品中糖蛋白的富集，結合標記定量技術，對血漿中的N-糖蛋白質進行了差異分析。該方法已成功應用于唾液、細胞質膜、血漿等具有重要生物學意義樣品中N-糖基化蛋白質組的分析與鑒定[25-26]。

酰肼化學法中糖鏈結構在富集過程中會被破壞，且其步驟繁瑣，Zhang等[27]開發了一種可逆酰肼固相萃取的富集策略。過程如下：首先，糖鏈中的糖環在苯胺的催化下形成醛的結構；其次，具有酰肼基團的固相顆粒與糖鏈的醛基反應形成共價腙鍵捕獲糖蛋白質/肽，通過洗脫液將未與固相顆粒結合的非糖蛋白質/肽洗去，從而實現糖蛋白質/肽的選擇性富集；最后，在pH值約為1.0～2.0的強酸性環境中腙鍵水解釋放出糖鏈，從而實現可逆過程。

酰肼化學法一般是將酰肼基團修飾于固相顆粒表面，利用固相顆粒與溶液中的糖蛋白質/肽作用，實現糖蛋白質/肽的特異性富集。因此，固相基質的類型也會對富集效果產生影響，Najam-Ul-Haq等[28]將纖維素、聚合物、金剛石作為基質材料修飾酰肼基團后，進行酰肼化學富集，并對其富集效果進行了評估，其中poly(GMA/DVB)基質的回收率達到89%，優于纖維素與金剛石(回收率分別為83%和71%)，實驗結果表明基質材料的親疏水性對于富集效果具有較大的影響。

此外，近年來發展了同樣基于醛基的胺化反應[23]和肟點擊化學法[29]用于N-連接糖肽的富集。胺化反應是利用固相載體中的氨基活性基團與糖鏈中鄰二羥基氧化生成的醛基反應，從而實現糖蛋白或糖肽的選擇性富集。肟點擊化學法是利用羥胺與醛基能夠發生親核加成生成穩定肟鍵，相比于酰肼反應，羥胺由于α-效應的親核能力更強，且反應條件溫和、產物穩定。這兩種方法與酰肼化學法類似，均不存在歧視效應，結合材料的不同特點，可滿足不同類型樣品的需求，提高糖基化蛋白質組的富集選擇性和特異性以及鑒定效率。

該類方法采用共價結合的方式，富集效率高且對糖鏈不存在歧視效應。同時可通過同位素或親和試劑進行標記，進行糖蛋白質組定量分析，因此，在高通量的N-型糖基化位點鑒定中得到了較好的應用。然而，富集過程中采用了強氧化劑進行氧化反應，這些氧化過程往往伴隨復雜的副反應，且會破壞糖鏈結構，從而嚴重限制了該方法在糖型解析上的應用。

1.3 親水作用色譜法

糖鏈中通常包含甘露糖、半乳糖、葡萄糖等單糖分子，這些單糖分子含有大量的羥基，因此糖基化肽段均具有較強的親水性，故親水作用色譜法(Hydrophilic interaction liquid chromatography，HILIC)也常用于糖肽的分離和富集[30]。該方法富集效果不受糖型的影響，不破壞糖鏈結構，且具有操作簡單、易于實現在線分析、與質譜兼容性好等優點，而被廣泛應用于糖蛋白質組樣品分析中。親水作用色譜基于親疏水性對糖肽進行富集，當樣品中存在含較多親水性氨基酸的非糖肽或疏水性較強的糖肽時，該方法的特異性不高。對此，可通過調節流動相或加入離子對試劑來提高親水作用色譜的選擇性，Kolarich等[31]采用ZIC-HILIC材料，比較了乙腈、甲醇、乙醇和異丙醇4種不同流動相對糖肽富集的影響，發現乙腈對于親水或者疏水的糖肽均具有較好的保留能力，乙醇和異丙醇對于疏水性糖肽具有較好的富集效率。Kelly等[32]通過采用加入離子對試劑(50 mmol/L的NaCl)中和多肽上的電荷，擴大了糖肽與非糖肽的親水性差距，從而提高了糖肽的富集選擇性。

近年來，各種適用于糖蛋白質/糖肽富集和分離的新型固定相不斷涌現，早期有裸硅膠基質固定相[33]，之后梁鑫淼等通過“點擊化學”的方法在硅膠基質上修飾親水性功能單體，形成各種HILIC固定相，如點擊麥芽糖親水固定相[34]、點擊L-半胱氨酸親水固定相[35]、點擊谷胱甘肽親水固定相[36]等，Selman等[37]也通過“點擊化學”的方法制備了多聚糖硅膠基質親水固定相，這些硅膠基質修飾的固定相均實現了糖肽的高選擇性富集。除上述在硅膠基質上修飾形成親水固定相外，Wang等[38]利用聚二乙氨基乙醇(DEAE)顆粒作為親水固定相進行糖肽富集，利用該親水材料對血漿中糖蛋白質組學進行分析，共鑒定出115個N-糖蛋白質和219個N-糖基化位點。張麗華等[39]發展了基于氫鍵輔助的親水作用富集材料并應用于小鼠腦組織N-連接糖肽的富集，共鑒定1 997條N-糖基化肽段，對應于686個N-連接糖蛋白，其中N-連接糖肽的富集選擇性高達94.6%。

由于金屬有機骨架(Metal-organic frameworks,MOFs )材料具有比表面積高、納米孔道有序、酸耐受能力高以及化學修飾性良好等特點，被越來越多地應用于生物樣品的預富集中。Yang等[40]通過在磁性石墨烯(Magnetic graphene,MG)表面合成引入ZIF-8，形成MG與MOFs的復合物MG@Zn-MOFs，利用該材料對1 μL的人血漿中糖蛋白質組學進行分析，共鑒定出151個唯一性糖蛋白質和517個N-糖肽。除了直接使用MOFs顆粒作為功能基團外，Bai等[41]以MOFs顆粒作為基質材料制備了表面富含半胱氨酸的親水富集材料，該材料具有高比表面積和超強的親水性等優勢。利用該材料對糖蛋白IgG的酶解產物進行糖肽富集檢測，其最低檢測限達1 fmol/L。利用該材料對溶菌酶中糖蛋白質組進行分析，共鑒定出1 123個N-糖基化位點，對應于1 069個N-糖肽和614個N-糖蛋白質。

HILIC 法具有富集條件溫和、操作簡單、糖鏈結構不被破壞、溶劑溫和以及易與質譜聯用等優點，被廣泛應用于實際樣品中糖肽的富集。然而，該策略對于親水性物質具有廣譜的富集效果，選擇性略低，并且由于糖蛋白質與非糖蛋白質在親水性上差異較小，限制了其在糖蛋白質水平上的使用。

1.4 硼親和法

硼親和法也是常用的糖蛋白質/糖肽富集策略。該方法原理是在堿性溶液中，硼酸分子中硼原子的雜化軌道由平面型的sp2雜化轉化為四面體型的sp3雜化，分子構型從平面三角形轉化為四面體，此時，硼酸分子可與帶有1,2位或者1,3位順式二羥基結構的糖鏈發生羥基化反應生成環狀二酯；當溶液環境轉變為酸性后，環狀二酯水解釋放出結合的糖鏈和硼酸分子，從而實現對糖基化蛋白質/肽的富集[42-43]。

近年來，以硼酸及其衍生物作為親和配體的硼酸類親和材料得到了迅速發展和應用。在早期的研究中，硼酸大多被作為流動相來實現對糖蛋白質/肽的選擇性富集，而目前已轉變為用作親和配體被修飾到磁性納米顆粒[44-45]、聚合物顆粒和硅膠顆粒[46-47]、整體材料[48]上。除上述基質材料外，Li等[49]發展了以MOFs材料為基質的硼親和材料：在Fe3O4表面生長MOFs晶體ZIF-8，之后將硅烷化的硼酸功能單體修飾于Fe3O4/ZIF-8上，形成復合物Fe3O4/ZIF-8/APBA。由于具有較大的比表面積，該材料對于糖蛋白OVA的飽和吸附量達到833.33 mg/g。

與糖蛋白質/糖肽的其它富集方法相比，硼親和法通過硼酸配基和糖鏈之間可逆的共價反應來實現對糖蛋白質/糖肽的富集，能夠保持糖鏈的完整性，為后續糖鏈的解析提供了可能；另外通過簡單的pH值調節，即可實現糖蛋白質/糖肽的富集與洗脫，操作簡單，且洗脫液多為酸性水溶液與質譜條件兼容。但是，硼親和法中硼酸與不同糖型之間的相互作用力強弱不同，若目標糖蛋白質/肽中糖鏈為相互作用力較弱的糖型則富集能力較差。近期有報道[50]以苯硼酸的衍生物作為單體制備了含有硼酸功能基團的聚合物，大大提高了與糖肽的結合能力和富集效率，在酵母細胞中鑒定到超過1 000個N-糖基化位點，在鼠腦中鑒定到4 691個N-糖基化位點，在人源細胞中鑒定到4 691個N-糖基化位點。

1.5 其它富集策略

除以上方法外，還發展了其它的N-糖肽富集策略：①與非糖肽相比，糖肽的分子構型一般大于非糖肽，Zhang等[51]采用SBA-15的介孔材料，利用其多孔性質，將樣品中的非糖肽吸附于孔道，從而實現了糖肽與非糖肽的分離；②某些含有唾液酸的糖鏈在酸性條件下帶負電，可通過二氧化鈦富集唾液酸糖肽，之后再利用HILIC分離降低樣品的復雜度，將該策略用于Hela細胞中糖蛋白質組分析，共鑒定出1 632條N-連接唾液酸糖肽，對應于817個N-糖蛋白質[52]。

2 展 望

目前，N-糖基化蛋白質組富集技術得到了快速發展，為N-糖基化蛋白質的規模化分析提供了技術支撐，極大地推動了糖蛋白質組學的進步。但目前大多數的N-糖基化蛋白質和糖基化位點仍未得到解析，因此，新富集方法的開發以及與質譜技術的更好結合對于糖蛋白質組學的研究及其生物學功能的解析仍然是十分必要的。另一方面，異常的糖基化修飾(包括特定糖蛋白質量的變化和糖基化結構的改變)與諸多病理過程密切相關，而且由于糖基化修飾的異質性使其具有宏觀和微觀不均一性，因此，針對特定糖基化修飾或糖鏈結構的專一性富集技術引起了研究者的極大興趣。隨著富集方法的不斷創新以及各類分析手段的發展，人類對糖基化修飾的認識會更加深入，糖蛋白質組學將會在疾病診斷、藥物靶點研究等方面發揮更大的作用。