高效液相色譜-串聯質譜法測定玩具中雙酚A的遷移量

李函珂,張 青,黃寧珊,周懿琦,林捷聰,林紹鵬,田 勇,蟻樂洲,劉崇華,黃理納

(廣東檢驗檢疫技術中心，廣東 廣州 510623)

作為一種用于制造塑料、環氧樹脂和其他材料的化合物，雙酚A(BPA)數十年來被大量生產和廣泛使用，已經導致人類的普遍暴露[1]。同時，雙酚A也是一種內分泌干擾物，可干擾激素的合成及代謝，且與人體生殖系統的多種病變相關，如前列腺增生和女性性早熟[2-3]。對于兒童,研究亦表明雙酚A暴露或導致兒童肥胖且可能對學習和記憶能力有副作用[4-5]。此外，妊娠期雙酚A暴露還可能影響兒童在3歲左右時的行為和情緒調節能力[6]。

鑒于雙酚A的暴露風險和兒童易受傷害的特質，歐盟 1272/2008號法規將雙酚A歸為第2類生殖毒性物質[7]。2014年，歐盟指令2014/81/EU明確規定玩具中單體雙酚A的遷移量不得高于 0.1 mg·L-1[8]。然而，由于歐洲食品安全局在2015年建議將雙酚A的每日耐受攝入量(TDI)臨時設為4 μg·kg-1·d-1[9],歐盟委員會的玩具安全專家組決定采用3 μg·kg-1·d-1作為雙酚A的TDI,最終使得玩具中雙酚A的遷移量在(EU)2017/898指令中被進一步降至 0.04 mg·L-1[10]。為了解特定條件下兒童與玩具的口部接觸雙酚A遷移量，歐盟玩具安全標準EN 71-10：2005給出了遷移條件，其中以水作為模擬液[11]，同時EN 71-11：2005還給出了測定雙酚A遷移量的高效液相色譜-二極管陣列-熒光檢測(HPLC-DAD-FLD)方法[12]。然而，上述標準所采用的遷移條件和檢測方法均已過時，其中，EN 71-9：2005中所采用的遷移溫度(20 ℃)不能代表口部接觸過程中可預見的最壞情形，且EN 71-10：2005中檢測方法的定量下限已接近2017/898指令中規定的雙酚A遷移限量[12]，故已無法滿足新指令的限量要求。因此，須采用更為合理的遷移條件并建立更可靠、靈敏的檢測方法，其定量下限通常應不高于限量的1/10(即LOQ≤4 μg·L-1)。雙酚A的測定已被廣泛研究，主要包括酶聯免疫法(ELISA)[13]、氣相色譜-質譜法(GC-MS)[14]，以及高效液相色譜(HPLC)與熒光檢測器(FLD)[15]、電化學檢測器(ECD)[16]、質譜檢測器(MS)[17]或串聯質譜檢測器(MS/MS)聯用的方法[18-19]。上述方法中，HPLC-MS/MS法因可檢測亞ppb級的雙酚A且受干擾和基體效應的影響小，而得到廣泛應用。

本文旨在建立和優化適于檢測痕量雙酚A遷移量的HPLC-MS/MS方法。同時，在實驗中亦發現聚酰胺(PA、尼龍66)和聚醚砜(PES)的針式過濾器可導致雙酚A的大量損失，但一些標準方法并未對該問題足夠重視，甚至存在錯誤，故按標準流程操作后可能獲得雙酚A遷移假陰性[20-21]。為此，本文首次系統全面地研究了遷移溶液過濾時所用針式過濾器對雙酚A回收率的影響，測定了玩具樣品的雙酚A遷移量，以評估玩具的雙酚A暴露水平。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

1200系列高效液相色譜儀(美國Agilent公司)、3200 QTRAP三重四極桿質譜儀(美國AB Sciex公司)、SW22 型恒溫水浴振蕩器(德國Julabo公司)。

雙酚A標準物質(純度99.8%，德國Dr.Ehrenstorfer 公司)。甲醇(色譜純，美國Fisher公司)；實驗所用去離子水均取自Milli-Q Direct 純水系統，電阻率不低于18.2 MΩ·cm。

0.45 μm 和 0.22 μm 混合纖維素(MCE)針式過濾器購自天津領航實驗設備股份有限公司；0.45 μm 和 0.22 μm 聚酰胺(PA，尼龍66)、聚醚砜(PES)和聚四氟乙烯(PTFE)針式過濾器購自天津津騰實驗設備有限公司；直徑約0.7 μm 四甲基氯硅烷(TMCS)去活的玻璃棉購自德國CNW Technologies公司；自制不同材質塑料片(50 mm×10 mm×1.0 mm)，材質包括丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物(ABS)、聚碳酸酯(PC)、聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚丙烯(PP)和聚亞苯基砜(PPSU)；含約10 g/kg雙酚A的自制聚氯乙烯(PVC)塑料片(50 mm×10 mm×1.0 mm)。

玩具樣品均購自廣州本地市場，包括玩具賽車、變形金剛玩具、玩具手槍和益智玩具套裝。

1.2 標準溶液配制

準確稱取一定量雙酚A，用甲醇配制為100 mg·L-1的雙酚A標準儲備溶液；用超純水將上述溶液逐級稀釋，得到質量濃度為2、5、10、 20、50、100 μg·L-1的雙酚A標準工作溶液。

1.3 樣品前處理

樣品前處理程序基于EN 71-9:2005條款6并進行了修改[11]：將玩具樣品剪為若干表面積為(10±1.0) cm2的小片，剪切過程中使玩具的不可接觸及內表面的面積最小。其后，將小片置于250 mL三角瓶中，并加入預熱至40 ℃的100 mL 水作為模擬液。將三角瓶加塞密封后，置于40 ℃恒溫水浴中，以150 r/min的頻率振蕩遷移1 h。遷移完成后，取一定體積模擬液，用MCE針式過濾器過濾后直接進行HPLC-MS/MS分析。

1.4 儀器條件

1.4.1色譜條件色譜柱：Poroshell 120 EC-C18RRHD 柱(100 mm×2.1 mm，2.7 μm，美國Agilent公司)；進樣體積：5 μL；柱溫：30 ℃；流動相：水(A)-甲醇(B)。梯度洗脫程序：0～4.00 min，50%～95% B;4.00～6.00 min，95% B;6.00～6.10 min，95%～50% B;6.10～10.00 min，50% B。流速：0.35 mL·min-1。

1.4.2質譜條件電離模式：ESI-；檢測方式：多重反應監測(MRM)；噴霧電壓：-4 500 V；離子源溫度：600 ℃；氣簾氣壓力：241.3 kPa；霧化氣壓力：241.3 kPa；輔助氣壓力：310.3 kPa；儀器控制和數據分析軟件：Analyst 1.6.2。優化后得到兩對響應較強的離子對m/z227.1/133.3、m/z227.1/211.1，其中m/z227.1/133.3用于定量，對應的去簇電壓、碰撞能量和碰撞池出口電壓分別為-58、-36、-4.0 V；m/z227.1/211.1用于輔助定性，對應的去簇電壓、碰撞能量和碰撞池出口電壓分別為-58、-33、-4.8 V。

2 結果與討論

2.1 遷移條件的選擇

圖1 不同遷移溫度下的雙酚A遷移量(n=3)Fig.1 BPA migration under different temperatures during migration(n=3)

考慮到遷移條件應能夠代表雙酚A對兒童暴露的可預見的最壞情形，本實驗以歐盟玩具標準EN 71-10:2005所采用的遷移條件進行修改。所用模擬液為去離子水，這是由于去離子水被廣泛用作模擬口部接觸過程中雙酚A暴露的模擬液[15,22-23]。此外，由于口部接觸時的溫度通常接近人體體溫(即37 ℃)，且Van Engelen等[24]建議若接觸溫度在20～40 ℃范圍內，則遷移溫度應選用40 ℃，因此本研究將遷移溫度設為40 ℃，這與EN 71-10:2005所采用的20 ℃不同[11]。圖1為不同溫度下含約10 g/kg雙酚A的PVC塑料片的雙酚A遷移量，由圖可見，當遷移溫度由20 ℃升至40 ℃后，雙酚A遷移量顯著上升，幅度達164%，該結果也進一步說明相較于20 ℃，40 ℃更能代表口部接觸時的最壞情形。

根據De Groot 和Juberg 等對兒童口部接觸時間的研究，將遷移時間設為1 h[25-26]。而根據 K?nemann 等[27]的研究，選用10 cm2作為樣品的表面積，以代表一個可輕易被兒童咬住的物體的最大表面積。

2.2 針式過濾器的影響

針式過濾器因操作簡便，常被用于液相色譜上機前溶液的過濾，常用過濾器的材質包括PA、PTFE等[28-29]。已有研究表明PA和PES過濾器均會導致雙酚A在過濾時大量損失[29-30]，因此，本研究采用MCE、PA、PES和PTFE 4種常用的不同材質過濾器對添加不同濃度(5、20、100 μg·L-1)雙酚A的水和甲醇進行過濾，濾液由HPLC-MS/MS測定并計算雙酚A回收率，結果如圖2。可見，經不同孔徑的PA和PES過濾器過濾后，水溶液中的雙酚A均大量損失，且僅當其達100 μg·L-1時才可被檢測到(圖2A)；0.45 μm的PTFE過濾器對雙酚A的回收率雖高于90%，但該過濾器無法完全過濾細小顆粒物，仍可導致液相色譜六通閥及色譜柱的堵塞；而用0.22 μm的PTFE過濾器時雙酚A損失則高達23%，表明雙酚A的回收率可能與過濾器的孔徑大小存在一定關聯；MCE過濾器對雙酚A的回收率均高于90%，可歸因于雙酚A與纖維素酯之間的相互作用較弱，且MCE過濾器中加入的醋酸纖維素可能抑制了雙酚A的吸附[30]，因此MCE過濾器可滿足本實驗要求；玻璃棉對雙酚A的回收率也均高于90%，但由于玻璃棉(GF)常用于對采集的水樣進行過濾以去除其中可見的固體顆粒，仍可能導致液相色譜儀堵塞，故不適用于本實驗[31]。此外，由圖2B可見，不同濃度的雙酚A甲醇溶液經PA和PES過濾器過濾后，其回收率明顯高于雙酚A水溶液，此結果亦得到 Salgueiro-González等[28]的證實，可歸因于甲醇對雙酚A的洗脫能力強于水。但對0.22 μm的PES過濾器和0.45 μm的PA過濾器而言，仍有高達20%的雙酚A損失，表明此兩種過濾器對雙酚A的保留機制不同，且過濾器材質會顯著影響雙酚A的回收率[32]。

將經不同體積分數(0%、25%、50%、75%、100%)甲醇溶解的100 μg·L-1雙酚A溶液分別由PA和PES過濾器過濾后，測定雙酚A的回收率，以考察甲醇含量對雙酚A回收率的影響。由圖可見，雙酚A的回收率隨甲醇體積分數的增大而增加(圖3A)，可歸因于甲醇對雙酚A的洗脫能力強于水。此外，僅25%的甲醇就可大幅提高雙酚A的回收率，可能是由于雙酚A在甲醇中的溶解度遠大于水中[33]。此性質為僅有PA或PES過濾器可用時提供了一個降低雙酚A過濾損失的替代方法，即將遷移溶液與甲醇按一定比例混合。

而Hebig等[34]研究也表明，使用針式過濾器時，通過棄掉一定體積的濾液，可大幅降低待測物在過濾時的損失，即過濾器中的吸附位點可被待測物飽和而在繼續過濾時不再損失。本實驗將100 μg·L-1的雙酚A水溶液分別由PA和PES過濾，但分別棄掉前0、1、2、5、10、15 mL濾液，以研究棄掉濾液體積與雙酚A回收率的關系(圖3B)。由圖可見，通過棄掉一定體積的濾液，雙酚A損失逐漸降低，且當棄掉濾液體積達15 mL時，除0.22 μm的PES過濾器損失了15%的雙酚A外，其余各過濾器的雙酚A回收率均已接近100%。進一步實驗表明，當棄掉濾液體積達25 mL時，該過濾器的雙酚A回收率升至100%，表明其吸附位點最多，故對雙酚A的吸附最強。若待過濾溶液中雙酚A濃度更低，則為使雙酚A回收率接近100%所需棄掉的濾液體積亦更多。同時，上述結論也為僅有PA或PES過濾器可用時提供了另一個降低雙酚A過濾損失的替代方法。但不論通過將待過濾溶液與甲醇混合亦或棄掉一定體積濾液，均遠不及直接使用MCE過濾器便捷，且后者對于大批量樣品處理更為有利，因此本文采用MCE直接過濾。

2.3 儀器條件的優化

2.3.1色譜條件的優化本實驗采用梯度洗脫，一方面是由于梯度壓縮效應可得到更窄的色譜峰[35]，有利于提高方法的靈敏度，另一方面，由于流動相的溶劑強度在洗脫過程中不斷增大，亦有利于減少色譜柱內的累積污染。同時，考慮到雙酚A的logKow值為3.0，且本文所用的液相色譜儀器的壓力上限為60 MPa，因此本實驗選用Poroshell 120 EC-C18柱(100 mm×2.1 mm，2.7 μm)進行分離。由于雙酚A的一、二級電離常數分別為9.4±0.3(pKa1)和10.37±0.07(pKa2)[36]，在水-甲醇體系(pH≤7.0)中其電離可忽略且主要以分子形式存在，故本研究采用水-甲醇作為流動相。

2.3.2質譜條件的優化在負離子模式下對雙酚A進行母離子掃描，得到去質子離子峰，即[M-H]-。其后，調節去簇電壓(DP)，使其響應最高。確定母離子后，繼續進行子離子掃描，其中m/z133.3和m/z211.1兩個子離子的響應最高(圖4A)，其形成可歸因于[M-H]-離子失去了CH4和C6H6O基團[37]。其后，調節碰撞能量(CE)和碰撞池出口電壓(CXP)使子離子響應最高。經優化，m/z227.1→133.3的響應最高，因此選其作為定量離子對。優化后的MRM參數如“1.4.2”所示。

上述優化條件下，50 μg·L-1雙酚A溶液的提取離子色譜圖(XIC)如圖4B所示。

圖4 雙酚A的碰撞誘導解離質譜圖(A)及提取離子色譜圖(50 μg·L-1)(B)
Fig.4 Collision-induced dissociation(CID)mass spectra of BPA(A) and extracted ion chromatograms(XIC) of BPA(50 μg·L-1)(B)

2.4 線性范圍、檢出限與定量下限

按“1.2”方法配制雙酚A系列標準工作溶液，在優化條件下進行HPLC-MS/MS分析。以得到的峰面積(y，counts)為縱坐標，雙酚A的質量濃度(x，mg·L-1)為橫坐標作圖，得到線性方程為y=4 220x-2 062，相關系數(r2)為0.999 4，曲線各點的回測精度為94.7%～110%，表明雙酚A在0.002～0.1 mg·L-1范圍內線性良好。此外，取ABS、PC、PET、PP和PPSU塑料片若干，加入一定量雙酚A標準溶液，按“1.3”方法處理，以得到的雙酚A濃度標準偏差的3倍和10倍分別作為方法檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)。結果顯示，本方法的檢出限和定量下限分別為0.30～0.52 μg·L-1和1.00～1.72 μg·L-1(表1)。

表1 不同材質塑料片中雙酚A的加標回收率、相對標準偏差(n=7)、方法檢出限及定量下限Table 1 Spiked recoveries,RSDs,LODs and LOQs(n=7) of BPA in plastic sheets made of different materials

(續表1)

MaterialSpiked(μg·L-1)Found(Mean±SD)(μg·L-1)Recovery(%)RSD(%)LOD(μg·L-1)LOQ(μg·L-1)100103±5.11035.0PC22.1±0.11066.70.451.502019.8±0.599.12.4100100.1±2.11002.1PET21.9±0.196.55.40.321.082019.6±0.897.74.3100101.8±4.01024.0PP22.1±0.21068.60.521.722020.8±1.51047.110096.8±7.296.83.7PPSU21.9±0.196.75.40.321.082020.6±0.51032.2100101.4±3.01013.0

2.5 回收率與相對標準偏差

以不同材質陰性塑料片為樣品，將其浸入模擬液后，分別添加不同濃度的雙酚A標準溶液，得到方法的回收率和相對標準偏差(RSD)。由表1可見，3個加標水平下雙酚A的回收率為96.5%～106%，RSD為2.0%～8.6%，表明本方法的準確度和精密度良好。此外，還測定了陽性PVC塑料片的雙酚A遷移量，以考察方法的日內和日間精密度。結果表明，該陽性PVC塑料片的日內和日間雙酚A遷移量分別為(4.3±0.2) mg·L-1和(4.1±0.3) mg·L-1，日內和日間RSD分別為4.0%和8.7%，表明本方法具有良好的日內和日間精密度。

2.6 實際樣品的測定

將本方法用于從廣州本地市場所購玩具的雙酚A遷移量測定，對所購玩具樣品上共計26個可觸及的塑料部件進行測試，以評估雙酚A的暴露水平。結果表明，上述塑膠部件的雙酚A遷移量均低于本方法的定量下限，滿足歐盟指令(EU)2017/898的要求。

3 結 論

本研究在歐盟玩具安全標準EN 71-10：2005的基礎上改進了遷移條件并建立了可靠且能直接檢測痕量雙酚A遷移量的HPLC-MS/MS方法，采用的遷移條件能夠代表兒童與玩具口部接觸過程中可預見的最壞情形，且方法的定量下限低至1.00～1.72 μg·L-1，可滿足2017/898指令中雙酚A限量(0.04 mg·L-1)的要求。研究表明，當樣品中含有大量雙酚A時，僅有極少數可遷移至模擬液中，故即使雙酚A遷移測試合格的樣品或仍含有大量雙酚A，因此雙酚A的潛在暴露風險仍然存在。同時，MCE過濾器的雙酚A損失最小，PA和PES過濾器的雙酚A損失最大，因而前者更適于遷移溶液的過濾。本研究亦提出了當僅有PA和PES過濾器可用時的兩種替代方法，即可將待過濾遷移溶液與甲醇混合或在過濾時棄掉一定體積的濾液，以減少雙酚A在過濾時的損失。