MEF兩種制備方法比較及接種密度的篩選

文│相榮科（山東省蘭陵縣畜牧局、北京農學院動物科學技術學院）

田興福（山東省蘭陵縣畜牧局）

高建明 穆祥（北京農學院動物科學技術學院）

胚胎生物技術在畜牧生產、培育新品種和基礎醫學研究上具有重要的理論和商業價值。胚胎干細胞技術則是胚胎分割、胚胎克隆、體細胞克隆、胚胎嵌合、轉基因動物生產等生物技術的樞紐。目前，胚胎干細胞技術已成為個體和器官發生發育、細胞分化和信號轉導、新基因發現及其功能表達調控、腫瘤發生等研究領域不可或缺的模型材料和工具。同時，在細胞及基因治療、轉基因動物、藥物開發等方面也顯示了潛力。

胚胎干細胞（ESCs）是具有發育全能性的細胞。在進行ESCs、精原干細胞等特殊細胞的研究時，往往需要成纖維細胞作為飼養層，已達到干細胞維持生物學特性的條件。同時，ESCs不僅可以作為體外研究細胞分化和發育調控機制的模型，還對移植治療、藥物發現及篩選、細胞及基因治療和生物發育等基礎研究等帶來深遠的影響。本研究通過酶消化法結合組織塊培養法培養小鼠胚胎成纖維細胞（MEF），力求為胚胎干細胞的培養和傳代提供方便、價廉、活性高、數量多、純度高的飼養層細胞，從而獲得量多、優質的ESCs，為以后深入的研究ESCs的分化提供優質和充足的材料。

本試驗以12.5～14.5天的小鼠胚胎為材料，通過酶消化法結合組織塊培養法分離培養MEF，對MEF生長狀況進行觀察并對MEF長滿孔板的時間進行統計分析；獲得的3～5代的MEF，以1×105/孔（低密度）、5×105/孔（中密度）、1×106/孔（高密度）不同密度接種，1天后觀察飼養層細胞鋪層情況；以購買的mESCs為材料，接種到不同密度的飼養層細胞上，觀察mESCs的生長情況。結果表明：通過酶消化法可以較短時間獲得原代MEF（2.18±0.19天），而組織塊培養為5.13±0.24天，酶消化法結合組織塊培養法可以獲得更多MEF；1×105/孔密度飼養層鋪層效果比較好，且mESCs生長狀況良好。

一、材料和方法

1.試驗材料。小鼠胚胎干細胞（mESCs）第3代。昆明白小鼠（SPF級，6～8周齡）購自北京實驗動物中心。按公母鼠1∶2的比例晚上合籠，次日早7：00檢查陰道栓。見栓日記為妊娠0.5天。選妊娠12.5～14.5天的孕鼠制備MEF。

2.主要試劑。孕馬血清促性腺素（PMSG）和人絨毛膜促性腺激素（hCG）、PBS（Gene Technology）、絲裂霉素-C、β-巰基乙醇、胎牛血清、0.25%Trypsin-EDTA消化液、特級胎牛血清。

3.培養液配制。MEF培養液：H-DMEM＋10% FBS＋100國際單位/毫升青霉素＋100微克/毫升鏈霉素。ESCs培養液：H-DMEM＋20% FBS＋0.1毫摩爾/升β-巰基乙醇（β-ME）＋2毫摩爾/升 L-谷氨酰胺＋100國際單位/毫升青霉素＋100微克/毫升鏈霉素＋1%非必需氨基酸＋10納克/毫升白血病抑制因子（LIF）。

4.MEF飼養層的制備。酶消化法結合組織塊培養法。

（1）酶消化法。取妊娠12.5～14.5天孕鼠脫臼法處死，75%的酒精浸泡5分鐘，無菌環境中打開腹腔，分離出子宮，無Ca2+、Mg2+的PBS洗凈血跡后，分離出胎兒和胎膜，洗凈血跡，把胎兒從胎膜中分離出來。去除胎兒頭、尾、四肢、內臟，無Ca2+、Mg2+的PBS洗滌后，將胎體剪碎成小于1立方毫米的組織塊，以1毫升/支胎兒的量加入0.25%Trypsin-EDTA消化液浸泡組織塊，37℃消化約5分鐘，倒置顯微鏡下觀察， 待較多細胞消化溢出后， 加入等量MEF培養液終止消化，輕微吹打，吸取上清液通過200目細胞篩后，以1000轉/分鐘離心5分鐘獲取細胞。調整細胞密度1×105個/摩爾，觀察成纖維細胞的生長情況和長滿時間。

（2）組織塊培養法。組織消化后的殘余組織塊經含10%FBS的DMEM洗滌兩次后分散置于培養板底部，每個組織塊間距約5毫米，加入少量FBS，培養箱中培養2～4小時后，再加入適量MEF培養液，將組織塊浸泡于培養基中。每3天換液一次，每天觀察。

5.飼養層制備。MEF通過10微克/毫升的絲裂霉素C處理2小時，接種到0.1%明膠包被的孔板上。接種密度分別為1×105/孔（低密度）、5×105/孔（中密度）、1×106/孔（高密度），1天后觀察細胞的鋪層情況，之后接種ESCs并觀察ESCs生長情況。

6.小鼠胚胎干細胞在飼養層上傳代。

（1）mESCs的解凍。準備37℃溫水，并把ESCs培養液預熱到37℃，加入9毫升預熱好的培養液添加到離心管中，把ESCs從液氮中取出，在3分鐘內，37℃迅速解凍解凍存管中的細胞。待完全解凍后，對凍存管管壁進行消毒，把ESCs轉移到盛有培養液的離心管中，注意不要產生氣泡。用1毫升培養液沖洗凍存管，減少細胞損失，并轉入離心管中，把懸浮液混勻，1000轉/分鐘離心5分鐘，吸去上清液，加3毫升ESCs培養液，制成細胞懸液。把ESCs接種到預先明膠包被的孔板中，37℃、5%CO2培養箱中培養。第二天，換液，待細胞長到70%～80%融合時，可以進行傳代處理。

（2）mESCs的傳代。首先移去ESCs培養液，用無Ca2+、Mg2+的PBS沖洗3遍，洗去殘留的培養液。用預熱的37℃的0.25%Trypsin-EDTA消化液消化20秒后，加入等量的ESCs培養液吹打使終止消化。之后把消化液轉移到離心管內，1000轉/分鐘離心5分鐘。吸去上清液，加3毫升ESCs培養液，制成細胞懸液，把mESCs接種到預先明膠包被的孔板中。37℃、5%CO2培養箱中培養。第二天換液，待細胞長到70%～80%融合時，可以進行再次傳代或凍存。

7.數據處理及分析。原代MEF長滿時間，利用SPSS軟件進行數據分析。

二、結果

1.不同方法培養MEF鋪滿孔板時間。酶消化培養MEF時，30分鐘MEF即可貼壁。倒置顯微鏡下觀察，MEF貼壁后。多有長短不等的數個突起，呈梭形、不規則三角形或扇形，核為卵圓形較大，細胞界限清晰，原代MEF2.18±0.1天即可長滿孔板（圖1A）。在原代時會有一些雜細胞，在第3代時，可得到較純的MEF，生長連成片，細胞緊密排列無間隙。

表1 MEF鋪滿孔板時間

◎圖1 不同培養方法MEF生長情況

◎圖2 不同接種密度飼養層鋪層情況

組織塊培養法2～3天后可觀察到大量細胞從組織塊邊緣游出，游出的細胞大多呈梭形，圍繞組織塊呈放射狀排列（圖1B）。5.13±0.24天后游出的細胞鋪滿孔板可傳代培養（圖1C）。

2.不同接種密度飼養層鋪層情況。由圖2可見，中等接種密度（圖2B）的飼養層鋪成單層效果比較好，較低接種密度（圖2A）孔板內細胞空隙較大，未能形成飼養單層，較高接種密度（圖2C）細胞排列較緊密。

3.mESCs在飼養層生長和傳代。ESCs細胞解凍后置于孔板中可見細胞小亮圓邊界清晰，胞漿少，細胞核大，核仁明顯。細胞排列致密，呈克隆狀生長（圖3）。ESCs克隆周圍平滑，倒置顯微鏡下觀察有很強的立體感，克隆邊界清晰、光滑，細胞排列緊密，細胞之間界限不清。隨著培養天數的增加，細胞克隆進一步增大，中央逐漸突起，倒置顯微鏡下觀察立體感更強，當細胞70%～80%融合時，需進行消化傳代。

從ESCs在不同飼養層密度上生長狀況來看，在較低密度飼養層上生長的ESCs形成的克隆小，克隆容易從板底脫落，很難達到克隆的融合；較高密度飼養層上生長的ESCs形成的克隆時間較長，達到融合時的時間也較長，且克隆中間部位細胞顏色加深，可能部分細胞已經老化；在中密度飼養層上生長的ESCs形成的克隆較快，克隆一旦形成，在1～2天既能達到融合。

ESCs消化后，按1∶2比例接種在MEF制作的飼養層上之后，約48小時即可出現典型的ES細胞克隆。克隆內細胞緊密地聚集在一起，細胞間界限不清，形似鳥窩，克隆周邊與飼細胞層界限清楚，無分化跡象。ESCs克隆一旦出現，即可快速生長。表現為克隆逐漸增大，中央逐漸隆起。待細胞長到70%～80%融合時，可以進行再次傳代或凍存。

三、討論

1.不同方法培養MEF。ESCs培養普遍采用飼養層，它已形成一種常規且穩定的ESCs培養方式。目前用于制備飼養層的細胞主要有MEF、HEF（人胚胎成纖維細胞）、STO（SIM小鼠胚胎成纖維細胞）。其中MEF在ESCs建系、擴增培養中最為常用。目前制備MEF的方法有酶消化法、組織塊貼壁法、酶消化法結合組織塊法，但形成細胞單層的時間和數量不同。郎洪彥等用酶消化法制備的MEF的原代培養形成細胞單層所需時間為2.3±0.1天，組織塊培養法制備的MEF形成細胞單層的時間為5.1±0.3天。

◎圖3 解凍后3天呈克隆狀生長的mESCs（100×，200×）

本試驗通過將酶消化培養法和組織塊培養法結合起來制備MEF，酶消化法制備的MEF的原代培養形成細胞單層所需時間為2.18±0.19天，組織塊培養法制備的MEF形成細胞單層的時間為5.13±0.24天。與郎洪彥等研究沒有顯著差別。但該方法既可以在較短時間內獲得大量MEF，從而在較短的時間內獲得飼養層；又可以根據鋪層時間上的差異，將一只母鼠制備的MEF分成兩批，從而獲得更多的MEF。

2.不同接種密度對MEF鋪層的影響。ESCs在飼養層上的生長對飼養層細胞的密度要求較高。王璐等在研究中發現，飼養層細胞密度過高，在與ESCs競爭養分的同時細胞本身易老化，易發生卷層現象，將胚胎干細胞包裹其中，無法分離。飼養層細胞密度過低，分泌分化抑制因子不足，ESCs易發生分化。Vitezslav Bryja等指出，飼養層細胞密度過高時，可以增加換液頻率；飼養層細胞密度過低時，可以補加飼養層細胞，以維持ESCs的培養條件。本試驗以三種密度制備飼養層細胞時，發現中等密度制備飼養層細胞較合適。

3.mESCs在飼養層上生長狀況。ESCs接種到飼養層細胞上之后，一般約24～48小時，最遲3～4天即可出現典型的ESCs克隆。細胞集落呈一典型的克隆狀生長，呈長梭形或橢圓形，結構均勻，表面光滑，細

胞小，克隆內細胞緊密地聚集在一起，界限不清，形似鳥窩，細胞中有一個大的核，核內可見到1～2個核仁，胞質較少。克隆周邊與飼養細胞層界限清楚，無分化跡象。ESCs克隆一旦出現，即可快速生長。表現為克隆逐漸增大，中央逐漸隆起。一般2～3天后飼養層上即可布滿大量的克隆。本實驗中觀察到的ESCs的生長情況與文獻中描述的相同，說明ESCs處于良好的生長狀態。

四、結論

本試驗通過酶消化培養法和組織塊培養法結合起來制備MEF，不同接種密度制備飼養層，之后讓ESCs在飼養層上生長，得出通過酶消化法可以較短時間獲得MEF，酶消化法結合組織塊培養法可以獲得更多MEF；中等密度飼養層鋪層效果比較好，且ESCs生長狀況良好。