分光光度法檢測酶促反應中底物的量

吳蕾 查春旺

摘 要：在化學實驗中酶促反應是十分常用的反應方式，我們時常利用這種反應方式來對底物的量進行檢測。由于酶自身所具有的特性，應用這種反應方式我們可以知道，當酶與底物進行結合之后，反應液中會出現游離的氨基酸逐漸的增多這一現象，并且反應液中所存在的游離氨基酸其自身的含量與底物的含量相同，因此利用這一方式我們可以有效的確定出底物的量，利用這一特性我們可以建立分光光度法，利用這一方法更加快捷的對底物的含量進行檢測。

關鍵詞：分光光度法 酶促反應 底物 分析與討論

中圖分類號：R927.2 文獻標識碼：A 文章編號：1672-3791（2018）06（a）-0151-02

酶檢測法由于其自身的特異性較強，所以在進行化學實驗的過程中常常會被應用在結構的分析或是進行化學性質的鑒定，利用這種方式來進行底物的量的檢測過程中無須進行相對于復雜的預處理，其自身的檢測速度比起其他的方式更加的快速，根據實際檢驗可以知道現階段的蔗糖酶α-淀粉酶、己糖激酶或是糖化酶這三種酶自身都可以用作這一實驗反應的過程中，并且利用這一方面來進行底物的量的檢測專一性更強，靈敏度也更高，在進行底物的量檢測過程中我們可以利用分光光度法進行檢測，這樣可以提高檢測的效率，更加方便我們進行檢測，本文的主要目的就是對分光光度法檢測酶促反應中底物的量進行簡單的分析和討論。

1 實驗材料與實驗的方法

1.1 實驗所用的主要材料

在進行實驗的過程中其主要的材料有以下幾種：α-淀粉酶、可溶性的淀粉、DL-蘋果酸、蔗糖酶、NACL、NA2HPO4、NAH2PO4。在進行實驗的過程中，要求實驗用水必須為雙蒸水。

1.2 實驗的方法

在進行實驗的過程中我們首先需要對溶液進行配制，然后需要根據不同的環境和反應下對實驗反應進行測定和記錄。

1.2.1 實驗所用的溶液的配制

有關蔗糖酶溶液在進行實驗的過程中的配制方式：首先在進行實驗之前抽取一定量的蔗糖酶將其溶于PBS的緩沖液中，要求PBS的緩沖液其自身為pH6.9，濃度為0.02mol/L對其進行配置，將其分別的配成溶液中的質量分數約為0.02%～0.028%的蔗糖酶溶液。

有關蔗糖溶液在進行實驗的過程中的配制方式：首先在進行實驗之前抽取一定量的蔗糖，將其分別的溶于PBS的緩沖液中，要求兩個PBS的緩沖液其自身的pH不同，而濃度均為0.02mol/L，并且將其制成PH質量分數為8.1%的蔗糖溶液以及pH為7.9的0.021%～0.076%的蔗糖溶液。

有關茚三酮溶液在進行實驗的過程中的配制方式：首先在進行實驗之前稱取0.52g的茚三酮，并將其溶于體積為100mL的雙蒸水中，得到5.2g/L的茚三酮水溶液，并將其保存在棕色瓶中。

1.2.2 在酶促反應中生成游離的氨基酸的測定

在對酶促反應中所生成的游離的氨基酸進行測定的過程中，我們需要做到的是在比色管中分別加入體積為1mL的蔗糖酶溶液以及體積為1.5mL的蔗糖溶液，在反應完全之后分別在兩個比色管中加入1mL，5g/L的茚三酮溶液，然后將兩個比色管放入溫度為95℃的水中進行時間為30min的水浴，水浴結束后需要將兩個比色管進行避光處理，時間為1h，最后在波長為570nm的分光光度計中測定其自身的吸光度，在實驗中我們也可以利用PBS的緩沖溶液來代替蔗糖溶液作為實驗中的空白對照。

1.2.3 溫度對于游離氨基酸含量的影響

在進行實驗的過程中為了測量溫度對于游離氨基酸含量的影響，我們需要將體積為1.0mL，含量為0.02%的蔗糖酶溶液以及體積為1.5mL的pH值為6.9的8.00%的蔗糖溶液進行實驗測量，將兩種溶液分別在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃中進行時長為1min的預熱，然后每組3個平行，反應的時間均為2min，以此來測量溫度對于游離氨基酸含量的影響。

1.2.4 pH值對于游離的氨基酸含量的影響

將含量為8.00%的蔗糖溶液與含量為0.02%的蔗糖溶液分別進行配置，將其配置成pH為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的溶液，然后比色管放在溫度為50℃的環境下進行時長為2min的反應，然后在波長為570nm的分光光度計中測定其自身的吸光度。

2 實驗結果與分析

2.1 游離的氨基酸含量的測定結果

在反應結束后分別取含量為0.10%的蔗糖酶以及含量為0.08%的蔗糖、含量為0.20的α-淀粉酶、含量為0.60%的淀粉溶液，對其進行分組反應以此來測定反應液中游離氨基酸的含量，如圖1所示。

從圖1中我們可以清楚的看出，蔗糖、蔗糖酶、α-淀粉酶、淀粉這4種溶液中其自身的游離氨基酸含量十分的少，而在酶與底物進行反應之后其反應液中所含有的游離氨基酸的量明顯增多。

2.2 反應的溫度對于游離氨基酸含量的影響

在實驗的進行過程中隨著溫度在不斷的升高，隨著溫度的升高，蔗糖酶反應液中其自身的吸光度首先會隨著溫度的不斷增加進行緩慢的增加，在增加到一定的值之后開始逐漸的降低，為此在進行溫度的選擇過程中不能夠過高也不能夠過低，為此選擇50℃來作為蔗糖酶的酶促反應是最佳的反應溫度，如圖2所示。會出現這種現象的原因有兩點。

2.2.1 溫度的升高導致分子運動速率加快

分子運動的速度會隨著溫度的增高而增快，這樣就直接加快了分子的碰撞概率使得反應的速率加快，同時也就直接的提高了反應液中游離氨基酸的含量。

2.2.2 溫度的升高會導致酶蛋白變形失活

一旦在進行反應的過程中酶蛋白變形失活就會導致酶促反應速率的降低，這就是溫度的升高會導致吸光度逐漸的降低的原因。

2.3 pH值對于游離的氨基酸含量的影響

在進行實驗的過程中隨著蔗糖溶液自身的PH增大，其反應液的吸光度會出現先逐漸增大而后逐漸的減小，如圖3所示可以知道其自身吸光度最大時反應液的pH值為8。在進行底物的pH選擇過程中需要我們從多方面來進行考慮，由于pH不同會影響酶促反應、影響茚三酮的顯色反應同時也會對游離的氨基酸含量有影響，所以在進行pH的選擇過程中需要我們綜合的考慮到每一個方面。

3 結語

根據本文綜上所述可以知道，在進行酶促反應的過程中利用分光光度法來進行底物含量的檢測可以有效的幫助我們更為準確的確定好數據，同時簡化操作的困難性，以蔗糖酶來作為實例可以知道，根據該方法自身的線性回歸方程：y=324.57x+0.0124（R2=0，9876），利用這種方法我們可以檢測出其方法檢出限為：36，17μg/mL，其自身的相對標準偏差約為2.3%～5.7%，而回收率約為96.54%～101.28%。利用淀粉酶自身的線性回歸方程來進行計算可以達到相同的結果，其自身的方法檢出限約為127μg/ml；其自身的相對標準偏差約為2.56%～5.47%，其自身的加標回收率約為95.76%～100.98%，由此可見利用分光光度法來進行底物的監測其這一方法的系統誤差相對于小，并且在進行數據的測定中更為準確。

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