翅萼石斛組織培養(yǎng)及快繁技術(shù)研究

仇 碩，趙志國，趙 健，夏 科，熊亞蘭，唐鳳鸞

（廣西植物功能物質(zhì)研究與利用重點實驗室/中國科學(xué)院廣西植物研究所，廣西 桂林 541006）

翅萼石斛（Dendrobium cariniferumRchb.f.）是一種喜陰涼的多年生蘭科石斛屬（Dendrobium）草本植物，產(chǎn)自云南南部至西南部，生于海拔1 100～1 700 m的山地林中樹干上。翅萼石斛具有較高的觀賞價值，花姿優(yōu)雅，玲瓏可愛，花色鮮艷，具有橘子香氣味［1］。近年也有研究報道了翅萼石斛的藥用成分，郝普彥等［2］采用GC-MS聯(lián)用技術(shù)對翅萼石斛的脂溶性成分進(jìn)行了分析鑒定，共鑒定出34種化合物，主要為烷烴類和酯類；也有對翅萼石斛藥材進(jìn)行鑒別的研究［3-4］，說明其具有較高的藥用價值。然而，翅萼石斛并沒有被中國藥典收載，而民間常作為石斛藥用品種，特別是云南等西南地區(qū)廣泛使用，加上生態(tài)環(huán)境的不斷破壞，致使野生資源數(shù)量劇減。

石斛屬是蘭科第二大屬，有1 500多個野生種和上萬個栽培種，如鐵皮石斛、金釵石斛等是名貴的藥用類石斛［5-7］；而觀賞類石斛蘭（常分春石斛系列和秋石斛系列）則是全世界公認(rèn)的四大洋蘭之一［8］，因此，該屬植物具有很高的藥用價值或觀賞價值。近10多年來，隨著組培技術(shù)的發(fā)展以及生產(chǎn)需要，一些高經(jīng)濟(jì)價值植物常利用組培快繁種苗［9-11］，蝴蝶蘭、文心蘭等名貴蘭花的規(guī)模化生產(chǎn)也通過組培快繁［12-15］。石斛屬植物中，鐵皮石斛、鼓槌石斛等已經(jīng)實現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)［16-18］，而翅萼石斛目前市場上銷售貨源主要靠野外采挖，破壞資源的同時也不能滿足市場需求。相比傳統(tǒng)分株繁殖技術(shù)，組培快繁技術(shù)具有繁殖速度快、繁殖系數(shù)高等優(yōu)點，特別是通過無菌播種規(guī)模化快繁種苗更簡單快捷，而且育苗成本更低［19-21］。翅萼石斛屬于石斛屬黑毛組（Dendrobium formosum）植物，可能因葉片和葉鞘被黑色毛而較難徹底消毒，目前沒有利用莖尖或莖段進(jìn)行成功誘導(dǎo)不定芽及無菌播種快繁研究的報道。鑒于此，本文以自交結(jié)實的翅萼石斛蒴果種子為材料，研究無菌播種及原球莖誘導(dǎo)、原球莖增殖及叢生芽誘導(dǎo)、生根壯苗以及移栽馴化等規(guī)模化快繁種苗的關(guān)鍵技術(shù)，旨在建立一套通過種子規(guī)模化生產(chǎn)翅萼石斛種苗的組培快繁技術(shù)體系，為其商業(yè)化推廣奠定基礎(chǔ)，也為其資源保護(hù)提供解決方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為翅萼石斛，2014年引自云南文山，種植于桂林市雁山區(qū)廣西植物研究所內(nèi)蘭花種質(zhì)資源圃，人工自交授粉，選用無病害、生長健壯的快要成熟但未開裂的蒴果作為外植體。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子消毒及接種 將快要成熟但未開裂的翅萼石斛蒴果采回后，用洗潔精清洗蒴果表面，再用自來水沖洗30 min，置于超凈工作臺上，用75%（V/V）酒精浸泡1 min，無菌水沖洗1次，0.1%升汞（HgCl2）浸泡15 min，無菌水沖洗5次，備用。

1.2.2 種子萌發(fā)和原球莖誘導(dǎo) 將經(jīng)過消毒的石斛種子切口，均勻撒播于備用培養(yǎng)基上，基本培養(yǎng)基選用MS+NAA 0.1 mg/L+瓊脂5.0 g/L+蔗糖20 g/L，并添加不同濃度的6-BA（1.0、2.0、4.0 mg/L），此外還選擇一個在6-BA 1.0 mg/L條件下加入1.0 g/L活性碳的配方，共4個處理，pH 5.8。每個處理播種20瓶，播種后置于組培室暗培養(yǎng)，待種子萌動變綠后轉(zhuǎn)到光下培養(yǎng)。

1.2.3 原球莖增殖和叢生芽誘導(dǎo) 將萌發(fā)的原球莖轉(zhuǎn)接到以下叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中：MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.1 mg/L+蔗糖20 g/L+活性碳1.0 g/L、MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+香蕉泥100 g/L+蔗糖20 g/L、MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+馬鈴薯泥100 g/L+蔗糖20 g/L。每個處理接種30個原球莖，重復(fù)3次，pH 5.8，然后置于LED光源、光照時間12 h、光強(qiáng)1 500～2 000 Lx、溫度25（±2）℃的條件下培養(yǎng)。

1.2.4 生根壯苗 當(dāng)小苗長出2～3片葉子、高1～2 cm，便可轉(zhuǎn)接到生根壯苗培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方設(shè)1/2MS+NAA 0.8 mg/L+香蕉泥200 g/L+蔗糖30 g/L+活性碳1.0 g/L、MS+6-BA 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+香蕉泥100 g/L+活性碳1.0 g/L兩個處理，pH 5.8，然后置于LED光源、光照時間12 h、光強(qiáng)1 500～2 000 Lx、溫度25（±2）℃的條件下培養(yǎng)。每瓶接種15～20個叢生芽，每個處理接種30瓶以上，重復(fù)3次。培養(yǎng)90 d后，隨機(jī)挑選無污染的10瓶，統(tǒng)計生根率，統(tǒng)計生根率、根長及株高等，取平均值。

1.2.5 移栽馴化 將生根試管苗分別于3～4月和6～7月移栽到室外煉苗，15～30 d后，洗凈根部培養(yǎng)基，移栽到經(jīng)多菌靈消毒處理的以下3種基質(zhì)中：水苔∶樹皮∶珍珠巖∶蛭石=10∶2∶1∶1（V/V）、樹皮∶珍珠巖∶蛭石=1∶1∶1（V/V）、水苔。用底部帶孔的塑料育苗盤（54 cm×28 cm）或塑料杯（9 cm×10 cm）種植，每個處理種植60株（叢）以上，3次重復(fù)。然后置于塑料大棚內(nèi)，夏季用70%遮陽網(wǎng)遮陰，移栽2個月后統(tǒng)計試管苗成活率及生長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 翅萼石斛種子萌發(fā)及原球莖的誘導(dǎo)

播種后經(jīng)過大約20 d的暗培養(yǎng)，翅萼石斛種子逐漸變綠，然后再過30 d左右膨大形成原球莖（圖1，封三），觀察統(tǒng)計種子在各種培養(yǎng)基中的萌發(fā)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，翅萼石斛種子在含有不同濃度6-BA的萌發(fā)培養(yǎng)基中均能萌發(fā)，但當(dāng)6-BA濃度為2.0、4.0 mg/L時容易黃化，特別是4.0 mg/L處理黃化嚴(yán)重、不能正常生長，而在1.0 mg/L 6-BA處理培養(yǎng)基中能繼續(xù)正常生長。此外，種子在同時含有1.0 mg/L 6-BA和1.0 g/L活性碳的培養(yǎng)基中未見萌發(fā)或僅少數(shù)萌發(fā)（圖1）。

2.2 翅萼石斛原球莖增殖及叢生芽的誘導(dǎo)

翅萼石斛原球莖增殖情況統(tǒng)計見表1。表1顯示，MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖20 g/L+活性碳1.0 g/L培養(yǎng)基中原球莖增殖及叢生芽誘導(dǎo)增殖系數(shù)最高，接種45 d后可以達(dá)到5.8個，且生長情況良好（圖2A，封三）。該配方與種子萌發(fā)及原球莖誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基一致，僅多增加了活性碳，如果不更換培養(yǎng)基，原球莖持續(xù)生長增殖，也可以誘導(dǎo)出叢生芽，但是苗很弱（未統(tǒng)計增殖系數(shù)，圖2D，封三）。翅萼石斛原球莖在含有香蕉泥和馬鈴薯泥的培養(yǎng)基中也具有較高的增殖系數(shù)，分別達(dá)到4.9和5.3個，生長情況也良好（圖2B、圖2C，封三）。可見，本研究選擇的3個原球莖增殖及叢生芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方效果都比較好，添加活性碳、香蕉泥或馬鈴薯泥對其原球莖增殖和叢生芽誘導(dǎo)結(jié)果影響不大。

表1 翅萼石斛原球莖增殖及叢生芽誘導(dǎo)統(tǒng)計情況

2.3 翅萼石斛叢生芽的生根壯苗

選擇生長健壯、苗長2～3 cm的翅萼石斛叢生芽接種到生根壯苗培養(yǎng)基中，3個月后觀察統(tǒng)計。翅萼石斛叢生芽在1/2MS+NAA 0.8 mg/L+香蕉泥200 g/L+蔗糖30 g/L+活性碳1.0 g/L培養(yǎng)基上生根率約為33%（表2），植株生長較差，根系短，平均根長只有3.80（±0.52）cm，株高只有4.40（±0.56）cm（圖3A，封三）。而在培養(yǎng)基MS+6-BA 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L+NAA0.2 mg/L+香蕉泥100 g/L+蔗糖30 g/L+活性碳1.0 g/L的培養(yǎng)基中生長則表現(xiàn)越來越好，組培苗葉片呈深綠色，100%生根，根系長8.90（±0.74）cm，株高平均9.30（±0.82） cm，苗健壯（圖3B，封三）。

表2 翅萼石斛叢生芽的生根壯苗統(tǒng)計情況

2.4 翅萼石斛瓶苗室外移栽馴化

翅萼石斛生根后的瓶苗移栽后2個月統(tǒng)計成活率，結(jié)果（表3）顯示，無論春季（3～4月）還是夏季（6～7月）的移栽，翅萼石斛在樹皮∶水苔∶珍珠巖∶蛭石=10∶2∶1∶1和樹皮∶珍珠巖∶蛭石=10∶1∶1的移栽基質(zhì)中均不能成活，移栽2個月后均不成活；而用水苔做移栽基質(zhì)，春季（3～4月）移栽成活率能達(dá)到76.7%、且長勢良好（圖4，封三），而夏季（6～7月）成活率只有15%、且后期長勢較差。

表3 翅萼石斛瓶苗室外移栽馴化情況統(tǒng)計

3 結(jié)論與討論

石斛屬植物因具有較高的經(jīng)濟(jì)價值而被廣泛關(guān)注，有關(guān)該屬植物的組培快繁技術(shù)已有很多報道，特別是名貴藥材鐵皮石斛早已實現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)［16，19］。為了應(yīng)對市場需求，本研究通過“無菌播種及原球莖誘導(dǎo)-原球莖增殖及叢生芽誘導(dǎo)-叢生苗生根壯苗-移栽馴化”建立翅萼石斛規(guī)模化生產(chǎn)的快繁技術(shù)體系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，翅萼石斛種子萌發(fā)和原球莖誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖20 g/L，種子萌發(fā)質(zhì)量隨6-BA濃度的升高而降低，高濃度6-BA（4.0 mg/L）會引起原球莖的死亡，這與余樂研究報春石斛無菌萌發(fā)的結(jié)果［21］相似。增殖系數(shù)的高低是組培快繁的關(guān)鍵技術(shù)之一，本研究發(fā)現(xiàn)添加香蕉泥或馬鈴薯泥對其原球莖增殖和叢生芽誘導(dǎo)結(jié)果影響不大，綜合認(rèn)為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖20 g/L+活性碳1.0 g/L最佳，45 d增殖系數(shù)達(dá)5.8，生長情況良好。本文篩選的培養(yǎng)基MS+6-BA 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+香蕉泥100 g/L+蔗糖30 g/L+活性碳1.0 g/L更適合翅萼石斛叢生苗的生根壯苗培養(yǎng)，生根率100%，根系長，組培苗健壯，葉片深綠色。

移栽馴化也是組培快繁技術(shù)是否成功的關(guān)鍵技術(shù)之一，前人對石斛屬植物組培生根苗的馴化大都利用水苔做基質(zhì)或者含有較高比例的水苔［22-24］。結(jié)合翅萼石斛的生長特性及前期引種馴化情況，本文選擇含少量水苔的移栽基質(zhì)（樹皮∶水苔∶珍珠巖∶蛭石=10∶2∶1∶1）以及不含水苔的移栽基質(zhì)（樹皮∶珍珠巖∶蛭石=10∶1∶1）進(jìn)行移栽，生長60 d后成活率均為0；而用水苔做基質(zhì)，3～4月份移栽成活率76.7%，表現(xiàn)良好，導(dǎo)致移栽成活率較低的原因可能與翅萼石斛不適應(yīng)桂林氣候有關(guān)。

圖1 翅萼石斛無菌播種培養(yǎng)

圖2 翅萼石斛原球莖增殖及叢生芽的誘導(dǎo)

圖3 翅萼石斛叢生芽的生根壯苗

圖4 翅萼石斛在移栽基質(zhì)水苔中的長勢