井岡霉素A對枯草芽胞桿菌R31生長和生物被膜形成的影響

樊勝南，陳川雁，喻國輝，黎永堅，陳燕紅，溫書恒

（1.珠海市現代農業發展中心，廣東 珠海 519075；2.廣東植物龍生物技術股份有限公司，廣東 珠海 519075）

井岡霉素是我國用量最大、最為成功的微生物殺菌劑之一［1］，是上海市農藥研究所20世紀70年代開發的一種氨基葡萄糖苷類農用抗生素，與日本的有效霉素結構相同，由吸水鏈霉菌的不同變種產生。其有效成分為井岡霉素A，在我國被大量用于水稻紋枯病、稻曲病、小麥紋枯病等真菌病害的防治［1-2］，其作用機理主要涉及對真菌海藻糖酶活性、纖維素降解酶、多聚半乳糖醛酸酶和肌醇生物合成活性的抑制，并能夠誘導植物產生系統抗性［3-4］。

井岡霉素和芽胞桿菌類殺菌劑混用可以協同增效，提高對水稻紋枯病等［5-9］病害的防治效果，這可能與井岡霉素能夠促進這些芽胞桿菌在防治對象定殖并形成優勢種群有關［10］。研究表明，生物被膜形成能力直接影響芽胞桿菌在寄主根際或葉際定殖，并最終影響芽胞桿菌對病害的防治效果［11-15］。芽胞桿菌生物被膜的形成受多種外部因素的影響，如植物根系分泌的蘋果酸［12］或多糖［16］，一些土壤微生物的次生代謝產物如表面活性素、制霉菌素等［17-18］。微生物產生的抗生素在亞致死濃度時具有誘導微生物產生生物被膜的作用［19］，而井岡霉素是土壤鏈霉菌產生的抗生素，兩者都是土壤中最常見的微生物［20］，是否通過產生的抗生素發生互作尚不清楚。

為探索井岡霉素A對芽胞桿菌游離生長和生物被膜形成的影響，本研究選擇枯草芽胞桿菌R31為研究對象。枯草芽胞桿菌R31是一株廣譜抗真菌植物內生芽胞桿菌［21］，具有持續控制香蕉枯萎病的能力［22］。R31能夠在香蕉、粉蕉和西芹根際和根圍長期定殖［23-24］，其對香蕉枯萎病的防治效果與其能在根系表面形成生物被膜，作為生物屏障阻礙香蕉枯萎病病菌的侵染有關［25-26］。本文通過測定井岡霉素A對枯草芽胞桿菌R31游離生長和生物被膜形成的影響，了解井岡霉素A對枯草芽胞桿菌R31的影響方式，為進一步開發和提高R31對大田作物的防效提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株：枯草芽胞桿菌R31，由珠海市現代農業發展中心農業微生物學實驗室分離保藏。供試培養基：LB培養基、BGM（Biofilm growth medium）培養基［27］。供試試劑：純度99.0%井岡霉素A標準品（北京勤誠亦信科技開發有限公司）、井岡霉素A60%原藥（武漢科諾生物農藥有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 枯草芽胞桿菌R31的活化和培養將-20℃保存的甘油種在LB上劃線，37℃靜置培養24 h，挑單菌落接種到5 mL LB液體培養基中，37℃、200 r/min振蕩過夜培養，發酵液作為種子液，以1%的量接入5 mL新鮮LB培養基中，培養至對數生長中期，用于生物被膜形成測定。

1.2.2 井岡霉素A標準品對R31生物被膜形成的影響測定 用新鮮的BGM培養基稀釋上一步培養獲得的發酵液，使其OD600為0.02，在稀釋好的培養液中添加不同濃度（36、60、100、150、200、300 μg/mL）井岡霉素A標準品，以不添加井岡霉素A標準品為對照，混勻后分裝到2 mL離心管中，每管1 mL，于37℃靜止培養3 d，觀察生物被膜形成情況。

1.2.3 生物膜的定量測定 參照文獻［27］方法，將BGM培養基和未附著的菌體從離心管中移走，然后用無菌水清洗以去除游離的菌體，并用濾紙條吸收離心管壁上附著的水珠。加入1%結晶紫1.5 mL，室溫下染色20 min，染色結束后，移走多余的結晶紫，用無菌水洗滌到無色，然后加入33%冰乙酸1.5 mL 洗脫結晶紫，測定洗脫液OD570值，用于判斷生物被膜的厚度。

1.2.4 60%井岡霉素A對R31生物被膜形成的影響測定 考慮井岡霉素A標準品的成本問題，后續研究選用60%井岡霉素A原粉開展。為校正標準品和60%井岡霉素A原粉的差異，采用同一方法檢測同濃度下60%井岡霉素A對R31生物被膜形成的影響。R31的培養和稀釋步驟同上，將稀釋好的培養液中添加不同濃度的60%井岡霉素A原粉，使井岡霉素A的濃度分別為 36、60、100、150、200、300 μg/mL，以不添加60%井岡霉素A為對照。其他步驟同上。

1.2.5 60%井岡霉素A對R31震蕩培養條件下游離生長的影響測定 根據1.2.2和1.2.4的測定結果，井岡霉素A在60 μg/mL時顯著抑制R31生物被膜形成，在100 μg/mL時對R31的生物被膜形成無影響，在200 μg/mL時顯著促進R31的生物被膜形成，因此選擇上述3個井岡霉素A濃度測定其對震蕩培養R31的生長影響。R31的活化如前所述，培養至對數中期的R31發酵液按照1%的接種量接種到LB培養基中，分別為100 mL瓶裝10 mL和50 mLLB培養基，以區別溶氧量，然后加入相應濃度的60%井岡霉素A，以不加60%井岡霉素A為對照，37℃、200 r/min振蕩培養，并在培養1、2、4、6、8、10、12 h測定發酵液OD600，繪制生長曲線。

1.2.6 60%井岡霉素A對R31震蕩培養發酵液中胞外多糖的影響測定 按照1.2.5的方法培養R31，培養體系選擇100 mL瓶裝10 mL LB培養基，在培養1、2、4、6、8、10、12 h分別取2 mL發酵液入10 mL離心管中，加入兩倍體積的95%的乙醇，充分混勻4℃下靜止30 min，4 000 r/min離心15 min，去上清，加5 mL乙醇靜止10 min，同等條件下離心去上清。將沉淀轉移到已經稱量好的錫箔紙（W1）中，于105℃下烘干至恒重。冷卻至室溫后稱重（W2），W2與W1的差值為多糖的重量［28］。

1.2.7 1%海藻糖添加對R31震蕩培養條件下游離生長的影響測定 按照1.2.4的方法培養R31，培養體系選擇100 mL瓶裝10 mL LB培養基。試驗設1%海藻糖，1%海藻糖加60%井岡霉素A 60 、100、200 μg/mL，以及不加海藻糖和井岡霉素的對照5個處理，培養1、2、4、6、8、10、12 h后測定發酵液的OD600，繪制生長曲線。

試驗數據采用DPS7.05軟件進行方差分析和鄧肯新復極差法檢驗，并用Excel 2007軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 井岡霉素A標準品對R31生物被膜形成的影響

從圖1可以看出，井岡霉素A對枯草芽胞桿菌生物被膜形成的影響存在非線性關系的濃度效應，井岡霉素A 36、60 μg/mL處理對R31的生物被膜無顯著影響，但井岡霉素A 100 μg/mL處理顯著抑制R31生物被膜的形成。隨著井岡霉素A濃度繼續升高，其對R31生物被膜形成的抑制轉成促進，井岡霉素A 200 μg/mL處理R31生物被膜厚度顯著高于對照。

圖1 井岡霉素A標準品對枯草芽胞桿菌R31生物被膜形成的影響

2.2 60%井岡霉素A原粉對R31生物被膜形成的影響

從圖2可以看出，60%井岡霉素A原粉按照標準品相應濃度處理后對枯草芽胞桿菌R31生物被膜形成的影響規律同標準品一致，唯一不同的是添加60%井岡霉素A原粉333 μg/mL配置成井岡霉素A終濃度為200 μg/mL的處理未顯著促進R31生物被膜形成，與標準品的結果有差異，可能與60%井岡霉素A粉劑中活性成分的濃度存在一定偏差有關。

圖2 60%井岡霉素A對枯草芽胞桿菌R31生物被膜形成的影響

2.3 60%井岡霉素A原粉對R31震蕩培養條件下游離生長的影響

溶解氧對R31的生長存在一定影響，溶解氧越充足，R31的游離生長狀態越好，表現為OD600值高，溶解氧不充足時R31的游離生長受到影響，表現為OD600值低（圖3）。溶解氧充足的狀態下，不同濃度的井岡霉素A對R31的生長表現出先抑制后促進的特點。培養6 h，井岡霉素A各處理間的OD600無顯著差異，但顯著低于對照；培養8 h，對照和低濃度（60 μg/mL）60%井岡霉素A處理的OD600顯著高于另外2個高濃度處理；培養10 h后，井岡霉素A不同濃度處理的OD600均顯著高于對照。

當培養體系中溶氧狀況較差時，各濃度的井岡霉素A對R31生長影響的總體趨勢沒有變化（圖3），但不同培養時間的情況存在差異。培養6 h，對照生長最好，不同濃度的井岡霉素A對R31的生長抑制表現為濃度越高、抑制越明顯；培養8 h，加入井岡霉素A的處理仍然抑制R31的生長，但以井岡霉素A 100 μg/mL的處理抑制最強；培養10 h，井岡霉素A 100 μg/mL處理對R31的顯著v抑制轉為顯著促進，另外兩個處理仍表現為顯著抑制；培養12 h，所有井岡霉素A處理均表現為對R31生長顯著促進，但存在濃度效應：濃度越高，促進的效果越差。說明在溶氧不足的情況下，游離生長的R31更容易受井岡霉素A的抑制。但當R31的菌體達到一定濃度時，抑制則轉化為促進作用。

圖3 井岡霉素A對枯草芽胞桿菌R31生長的影響

2.4 60%井岡霉素A對振蕩培養R31胞外多糖產生的影響

從表1可以看出，除培養2 h檢測到60 μg/mL井岡霉素A處理R31胞外多糖含量顯著高于其他處理外，其他培養時間各處理間差異不顯著，顯示井岡霉素A對R31游離生長時胞外多糖的分泌無影響。

表1 不同濃度60%井岡霉素A處理枯草芽胞桿菌R31胞外多糖分泌量（g/L）

2.5 1%海藻糖促進R31生長和消除井岡霉素A對R31生長抑制作用

從圖4可以看出，海藻糖的加入可以促進R31生長，并消除不同濃度井岡霉素A對R31生長的抑制。培養6 h，除60%井岡霉素A 100μg/mL處理表現為抑制R31生長外，其他所有處理都表現為促進R31生長，而不加海藻糖的井岡霉素A各濃度處理此時均顯著抑制R31的生長（圖3A）。培養8 h，所有加入海藻糖后的井岡霉素A處理均促進R31的生長。在不同濃度井岡霉素A處理中加入1%的海藻糖，能不同程度消除井岡霉素A在R31生長前期的抑制效應，但是在井岡霉素A 60 μg/mL和200 μg/mL處理中能較早消除抑制，而在井岡霉素A 100 μg/mL處理中，則需要延遲2 h才能消除抑制，具體原因還需進一步研究。

圖4 1%海藻糖促進枯草芽胞桿菌R31生長并消除井岡霉素A對R31生長的抑制

3 結論與討論

生物被膜形成是芽胞桿菌類生防菌在自然界定殖并發揮防效的先導機制［11］，當其在植物葉際或根系表面形成生物薄膜后，就可以與病原菌競爭生態位，并通過釋放各種抑菌物質來影響病原菌的生長與定殖，或影響植物的抗性，以達到防治病害的效果［12-15］。枯草芽胞桿菌R31在大田中對香蕉枯萎病表現出良好的防治效果，與其具有較強生物被膜的形成能力有關［26］。研究表明，井岡霉素A可以促進枯草芽胞桿菌在寄主根際和葉際定殖［5］，顯示井岡霉素A可能對枯草芽胞桿菌的生物被膜形成產生影響。通過測定井岡霉素A對枯草芽胞桿菌R31生物被膜形成的影響發現，井岡霉素A在低濃度（36、60 μg/mL）可以促進R31的生物被膜形成，在較高濃度（200 μg/mL）才可以顯著促進R31的生物被膜形成，這與陳志誼等［5］報道的結果非常吻合：使用5%井岡霉素與Bs916對半混合使用時，混合后體系的井岡霉素A濃度為250 mg/mL，稀釋后最終噴施時的井岡霉素A濃度會更低，但仍然在生產上表現出對Bs916定殖的增效作用。利用5%井岡霉素和200億孢子/g枯草芽胞桿菌可濕性粉劑開展的研究也表現出類似結果，當兩者1：1混配，混配系統中井岡霉素A的濃度達到125 mg/L時，對小麥紋枯病的預防效果達到75.1%，超過50%多菌靈和5%井岡霉素可濕性粉劑［8］，室內測定的防效隨井岡霉素濃度增加而增加。這些文獻報道與本研究結果一致，說明井岡霉素A和芽胞桿菌協同增效的機制通過井岡霉素A促進芽胞桿菌生物被膜形成來實現，但井岡霉素A通過哪種機制來促進枯草芽胞桿菌生物被膜的形成，值得深入研究。

井岡霉素A在100 mg/mL時表現出對枯草芽胞桿菌生物被膜形成的抑制，與嚴清平等［10］報道結果一致，利用60%井岡霉素A開展的平板抑菌實驗也顯示，100 mg/mL的井岡霉素A對12株參加測試芽胞桿菌中的9株表現出抑制作用，但繼續增加井岡霉素A的濃度，抑制反而轉成促進，顯示高濃度的井岡霉素A和枯草芽胞桿菌制備成復合制劑還是可能的。

井岡霉素A對游離生長的枯草芽胞桿菌表現出抑制，溶氧充足，芽胞桿菌生長速度快的，能夠較早消除抑制，此時，井岡霉素A對芽胞桿菌的抑制轉化成促進作用，而溶氧不足，菌株生長緩慢的，抑制時間延長，但最終都轉換成促進作用。顯示井岡霉素A對芽胞桿菌的抑制存在菌體濃度效應，這可能與芽胞桿菌自身的群體感應有關。在液體培養基中，枯草芽胞桿菌生物被膜形成被啟動的基礎菌體濃度是3×107CFU/mL［29］，當枯草芽胞桿菌菌體濃度未達到啟動生物被膜形成的濃度時，生長受到井岡霉素A的抑制，一旦菌體濃度達到足夠啟動生物被膜形成后，由于某種未知機制，井岡霉素A轉而促進枯草芽胞桿的生長。

井岡霉素A的生物活性之一是抑制真菌或昆蟲的海藻糖酶活性，影響真菌和昆蟲對海藻糖的利用并最終發揮防效，在培養基中添加1%的海藻糖可以恢復井岡霉素A對枯草芽胞桿菌游離生長的抑制，顯示其對R31游離生長的抑制與對R31海藻糖的利用影響有關，但具體通過哪些途徑影響R31的海藻糖代謝尚需進一步研究。胞外多糖是枯草芽胞桿菌生物被膜中的主要成分之一，但對井岡霉素A不同處理的不同培養時間點R31培養液中胞外多糖的定量測定，差異不顯著，顯示井岡霉素A可能不是通過影響R31胞外多糖的產生而影響其生物被膜的形成。

井岡霉素和枯草芽胞桿菌都是我國重要的生物農藥，本研究發現井岡霉素A可以促進枯草芽胞桿菌的生物被膜形成，對生產上進一步開發兩種生物農藥以擴大防治對象和提高防效具有重要的意義，同時也為進一步開展基礎研究以揭示兩者作用機理奠定了理論基礎。