一株產靈菌紅素粘質沙雷氏菌株培養條件探索

蔡麗娜　付陳增

中圖分類號：Q939.97 文獻標識碼：A 文章編號：1003-9082（2018）10-0-01

靈菌紅素（prodigiosins，PG）是一類天然紅色素的總稱，通常都有3個吡咯環組成的甲氧基吡咯骨架結構，是由多種放線菌、沙雷氏菌、鏈霉菌屬、假單胞菌屬等產生的次級代謝產物[1]。根據其側鏈基團結構的不同，可分為靈菌紅素、間環丙菌素、十一烷基靈菌紅素、壬烷基靈菌紅素和環丙烷靈菌紅素等系列結構類似物（圖1）。靈菌紅素呈暗紅色，綠色反光，熔點151～152℃，屬于脂溶性色素，易溶于甲醇、丙酮、氯仿、苯、DMF和DMSO，幾乎不溶于水[2]。靈菌紅素對光不穩定，需要避光保存[2]。靈菌紅素受pH 值的影響較大，在酸性環境中能保存較長的時間，在堿性條件下則不穩定。近年來研究顯示PG具有抗細菌、抗真菌、抗瘧疾、免疫抑制和抗腫瘤等多種活性。

一、材料與儀器

1.菌種

本實驗室自有產靈菌紅素的S. Marcescens y2菌株（y2+），經篩選純化獲得不產色素突變菌株（y2-），以y2-菌株作為對照，減少色素對菌體本身的作用，來檢測外界環境因子對粘質沙雷氏菌生長繁殖的影響。

2.培養基

前期研究發現，分別采用LB培養基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基PDA及SN培養基（蔗糖20g/L、牛肉膏18g/L、CaCl21.1g/L）培養S. Marcescens y2菌株，28℃、200rpm條件下SN培養基可以獲得較高產量的靈菌紅素，且菌量較多。

3.試劑與儀器

722可見光分光光度計（上海精密科學儀器有限公司），Varian cary 100型紫外可見分光光度計（Agilent Technologies），TGL 16G臺式低溫高速離心機（上海醫用分析儀器廠），Thermo MK3酶標儀。

二、實驗方法

1.細菌培養

從平板上挑取單菌落至30mlSN液體培養基中，28℃、200rpm振蕩培養至OD600=0.1，再分別以100μl新鮮菌液接種到30mlSN液體培養基中28℃、200rpm振蕩培養48h，用以觀察鑒定。

2.細菌生長量及靈菌紅素產量測定

將菌液稀釋十倍后取200μl至96孔板中，用酶標儀在630nm波長下檢測吸光值OD630nm來表示菌的生長量。分別取1ml菌液至1.5mlEP管中，8000rpm、10min離心取上清，用pH=2.5的酸性甲醇溶液稀釋2倍后，用紫外可見光光度計掃描檢測，在535nm波長下有最大吸收峰，以OD535nm表征胞外色素產量；將沉淀用1ml、pH=2.5的酸性甲醇溶液振蕩混勻，放置30min，提取胞內色素，適當稀釋后，檢測方法同胞外色素，以535nm處吸收峰峰值表征胞內色素產量。

三、結果與分析

1.生長曲線測定

28℃、200rpm振蕩培養y2+、y2-，分別在0、2、4、8、12、24、30、36、48、60、72、96取新鮮菌液200μl至96孔板，設置3個重復，酶標儀檢測OD630nm，獲得生長曲線如下圖Fig.1所示。結果顯示y2+菌株比y2-提前進入指數生長期，但都在36h時進入穩定期，可見產色素菌株為次級代謝產物靈菌紅素的生產而適當延長指數生長期，靈菌紅素代謝過程可能與細菌生長周期相關蛋白的調控相關。

2.靈菌紅素光譜掃描鑒定

光譜掃描圖清晰顯示，在pH2.5的甲醇溶液中，靈菌紅素在535nm處有最大吸收峰。

四、討論

色素的產生是微生物在長期進化過程中為了適應環境的改變而形成的代謝產物，與其產生菌的生存能力及對環境的適應能力有著很重要的作用和意義。近些年的研究發現，靈菌紅素是部分放線菌、粘質沙雷氏菌、弧菌及假單胞菌等細菌的次級代謝產物，具有抗細菌、抗真菌、抗瘧疾、抗腫瘤及免疫抑制能多種生物活性，對多種抗腫瘤藥、抗菌藥、免疫抑制劑的開發都用著較高的應用前景。但是靈菌紅素對其產生菌本身的作用研究甚少，研究二者的相互關系對靈菌紅素的生產及應用都有著重要的意義。本研究以篩選得到不產色素的突變菌株y2-作為細菌生長情況的對照，排除色素的干擾作用，通過改變外界環境因素來檢測粘質沙雷氏菌y2+菌株的生長量及色素產量，從而揭示粘質沙雷氏菌的生長繁殖和靈菌紅素的生產與環境因素之間的相互作用、相互影響。

從天然藥物中提取純化化合物，并篩選出具有抗腫瘤活性的天然產物，或者以天然產物作為先導化合物進行結構修飾，合成其衍生物看是否具有抗腫瘤活性，進而開發出臨床有效的抗腫瘤藥物，一直是抗腫瘤藥物研究領域追求的目標之一。由于靈菌紅素的“細胞毒性"目前作為免疫抑制藥物仍然受到限制。但以靈菌紅素化合物作為基本骨架結構，尋找免疫抑制活性強、毒副作用低的衍生物有較好的前景因而備受關注。目前靈菌紅素通常是以沙雷菌為生產菌株，通過發酵制備并提純其代謝產物而獲得。由于制備過程的原因，難以大量生產，影響對其的進一步研究。

參考文獻

[1]王飛，羅海瀾， 劉暢， 王建國， 李林珂， 等. 一株粘質沙雷氏菌的分離和產紅色素初步研究. 食品工業，2011，174： 53-55.

[2]王飛，羅海瀾， 周銀芳， 李囡囡， 劉素， 等. 不同光照、氮源對Serratia marcescens y2生長及色素產量的影響. 食品科學，2012，33： 234-240.