大花六道木葉片直接誘導不定芽再生研究

李水根，關 媛，李記開，劉秀云，李秀芬，朱建軍*

(1上海市農業科學院林木果樹研究所，上海，201403；2上海農林職業技術學院，上海，201600)

六道木為忍冬科(Caprifoliaceae)六道木屬(Abelia)灌木，由于樹干生長時有六道凹槽，加工成珠子后具有六道白邊，故名六道木[1]。大花六道木(Abeliagrandiflora)是六道木中較早出現的園藝種，為半常綠矮化灌木，由中國的糯米條(A.chinensis)和單花六道木(A.uniflora)雜交而成，后經國外育種，形成了一些更有特色的園藝品種[2]，目前國內已有引進，但數量非常有限。大花六道木生長快，枝條柔順下垂，樹姿婆娑，株型非常美麗[2-3]。每年從初夏至仲秋都是大花六道木的盛花期，花量大且花期長，開花時節滿樹白花，晶瑩剔透，襯以粉紅的花萼、墨綠的葉片，分外醒目[4]。即使白花凋謝，紅色的花萼還可宿存至冬季，連片種植時極為壯觀。大花六道木根系發達，對土壤和肥力的要求不高，耐干旱、貧瘠和鹽堿，萌蘗力、萌芽力很強，同時可反復修剪。大花六道木園林用途廣泛，適宜叢植、片植于空曠地塊、水邊或建筑物旁。既可修成規則球狀列植于道路兩旁，或做花籬，也可自然栽種于巖石縫中、林中樹下[5]。華東、西南及華北可露地栽培，是庭院綠化觀賞和園林綠化設計的優良樹種[6]。

雖然大花六道木的品種繁多，觀賞效果極佳，但由于其種子小，不易收獲，部分觀賞品種幾乎不結種子，只能通過扦插繁殖[7]，繁殖時需要大量的母株插條，繁殖系數低且費時費力。目前，國內外對六道木組織培養的研究較少，根據已有文獻報道，以前的組織培養方法均是通過培養具有生長點的莖段直接誘導器官發生的方式獲得無菌苗[8-10]，然后通過無菌短枝扦插或叢生芽的方式實現植株擴繁增殖，此方法增殖系數為每30 d增殖2.8倍左右[8]。大花六道木葉片誘導愈傷發生較容易，但愈傷難以分化成不定芽[9-10]。在生根培養時植株基部又容易產生愈傷組織，導致生根困難。本試驗主要對大花六道木葉片不定芽誘導和生根培養進行研究，從而實現大花六道木的離體再生和規模化繁殖。

1 材料與方法

1.1 材料及外植體消毒

以上海市農業科學院奉浦院區苗圃栽培的大花六道木為試驗材料，于2017年4月份采集剛展開的幼嫩葉片。于自來水水龍頭流水下沖洗1—2h，轉入超凈工作臺進行消毒，體積分數為75%的酒精浸泡1 min，質量分數為0.1%的升汞消毒5—10 min，消毒過程中不斷搖晃使消毒液充分浸泡材料，然后用無菌蒸餾水沖洗至少5遍，用無菌吸水紙吸干多余的液體后備用。

1.2 不定芽誘導及叢生芽增殖

將消毒好的葉片剪成約1 cm2的小方塊，葉片近軸面朝上接種于不定芽誘導培養基上，不定芽誘導培養基采用改良MS(MS大量元素減半)為基本培養基，同時添加不同濃度的細胞分裂素6-BA(6-芐基腺嘌呤)、KT(6-糠基氨基嘌呤)、生長素NAA(萘乙酸)、30gL蔗糖和2.8 gL結冷膠。將培養基于120 ℃，20 min條件下高溫高壓滅菌后分裝于直徑為9 cm的培養皿中。試驗共設計5個處理：KT 0.4 mgL；6-BA 0.2 mgL；6-BA 0.4 mgL；6-BA 0.8 mgL；6-BA 0.4 mgL+NAA 0.05 mgL(表1)。每個處理包含6皿。在25 ℃、黑暗條件下培養，每隔1個星期觀察1次。1個月后統計愈傷和不定芽誘導情況。誘導率=(愈傷或不定芽發生的數量/外植體數量)×100%。

表1 不同激素處理對大花六道木不定芽誘導的影響

增殖培養基組分參考汪思奇等[8]的研究。將培養基分裝于瓶中，每瓶裝入約50 mL培養基。然后置于高溫高壓滅菌鍋中，在120 ℃、20 min條件下滅菌后冷卻備用。將不定芽從外植體上切下，轉接于增殖培養基，置于25 ℃，光照強度2 000—3 000 lx、光照周期16 h8 h(白黑)條件下，培養并形成叢生芽。

1.3 不定芽生根

待增殖培養基中生長的不定芽長度大于1 cm時，將其轉接于生根培養基上。生根培養基組分采用L9(34)正交試驗表進行設計，包括4個試驗因子(基本培養基、IBA、NAA、蔗糖)，每個因子包含3個水平(表2)，每個處理設置3次重復，每瓶接種10個不定芽，培養條件與增殖培養相同。培養1個月后統計生根率，取平均值。生根率=(生根的植株數量/接種的植株數量)×100%。

表2 L9(34)生根培養基正交試驗設計

1.4 數據分析和圖像處理

采用DPS軟件進行正交試驗設計和統計分析，方差分析采用Duncan多重比較，顯著水平為P<0.05。圖片處理采用Adobe photoshop CS3和Adobe illustrator CS5。

2 結果與分析

2.1 不定芽誘導培養基的篩選

將大花六道木葉片剪成小方塊接種于誘導培養基，在培養約15 d后葉片出現彎曲，拱起或上翹，葉片傷口處開始膨大。隨著培養時間的延長，部分葉片保持綠色，并在傷口處產生愈傷組織和不定芽，而其他葉片黃化，甚至褐化死亡(圖1a)。

在含不同植物生長調節劑的培養基上，葉片的反應差異很大。不定芽和愈傷的誘導率統計結果見表1。其中，在改良MS培養基中添加6-BA 0.4 mgL和0.8 mgL的兩個處理中，葉片周圍均有不定芽發生，誘導率分別約為35%和18%。但是，當6-BA為0.4 mgL時，葉片周圍只有不定芽發生，且幾乎沒有愈傷組織形成(圖1b)。而在0.8 mgL的6-BA處理中，葉片周圍既有不定芽發生，同時伴有愈傷組織產生，愈傷組織的誘導率達到46%左右。在同時添加0.4 mgL 6-BA和0.05 mgL NAA的處理中，沒有不定芽發生，而愈傷組織的誘導率提高到66%左右。在分別添加0.4 mgL KT和0.2 mgL 6-BA的兩種培養基上，葉片既沒有愈傷組織發生，也沒有不定芽形成。值得注意的是，隨著培養時間的延長，所有處理條件下誘導的愈傷組織均逐漸褐化凋亡，為非胚性愈傷組織，沒有再生能力。因此，添加6-BA 0.4 mgL的改良MS最適合于大花六道木葉片通過直接器官發生途徑，誘導不定芽再生。

將不定芽從外植體上切下，轉接于增殖培養基上，培養1個月左右，不定芽通過增殖形成叢生芽，每團叢生芽含有數十棵植株(圖1c)，增殖效果明顯。

a：外植體培養15d；b：不定芽直接發生；c：叢生芽增殖；d：組培苗生根；e：組培苗移栽馴化圖1 大花六道木葉片誘導不定芽再生、增殖及生根過程Fig.1 The process of shoots induction，proliferation and rooting

2.2 大花六道木植株不定根發生的影響因子研究

以增殖后長度大于1 cm的不定芽為試驗材料，進行誘導生根研究。基本培養基、IBA、NAA和蔗糖濃度對不定芽生根率影響見表3。就各因子對生根率的影響分別進行統計學分析，結果表明：在3種基本培養基之中，不定芽生根率最高的為WPM培養基和MS培養基，兩者差異不顯著。在不同濃度的IBA處理中，0.5 mgL和1.0 mgL 兩個水平下，不定芽生根率差異不顯著，但均顯著高于未添加IBA的處理，考慮到節約成本，采用IBA 0.5 mgL的水平。在3個濃度的NAA處理中，1.0 mgL的NAA處理后的不定芽生根率顯著高于其他兩個濃度處理后的生根率。在含不同濃度蔗糖的培養基中，其中添加20gL蔗糖的培養基中不定芽生根率顯著高于其他兩個處理水平。正交方差分析(表4)表明，不同試驗因子對大花六道木不定芽生根率的影響差異顯著。對各因子的極值進行比較分析表明，基本培養基、IBA、NAA和蔗糖的極差大小分別0.2519、0.2878、0.301、0.5312，因此對大花六道木生根的影響因子的主次關系為蔗糖>NAA>IBA>基本培養基。根據各因子水平的大小，最后得到最優的生根培養基組分為WPM(或MS)+ IBA 0.5mgL+NAA 1.0 mgL+蔗糖 20gL。

表3 大花六道木誘導生根的正交試驗方案與結果

表4 4個試驗因子對大花六道木不定芽生根率的正交試驗統計學分析

注：同行中不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著

對優化的培養基進行試驗驗證，結果得到生根良好的大花六道木植株(圖1d)，生根率達到90%以上。將根系發育良好的組培苗移栽到溫室進行馴化，采用草炭∶珍珠巖=4∶1的栽培基質，移栽成活率在95%以上(圖1e)。

3 討論

3.1 6-BA促進大花六道木不定芽再生

植物離體再生的關鍵步驟是植物已分化的體細胞實現脫分化，獲得干細胞功能[11]這一過程。此過程一般誘導形成具有再生能力的愈傷組織，或不經過愈傷組織而直接實現器官發生。本試驗通過直接器官發生的方式，誘導大花六道木的葉片發生不定芽，雖然伴隨少量愈傷組織形成，但不需要單獨誘導愈傷組織進行器官分化，可以減少再生過程中遺傳變異的概率。在脫分化的過程中生長素和細胞分裂素發揮重要作用。試驗發現，添加低濃度6-BA的改良MS培養基最適合誘導不定芽，實現大花六道木的不定芽再生，可應用于遺傳轉化的受體系統。與采用莖段繁殖相比，葉片作為外植體誘導不定芽發生，可以顯著提高大花六道木的增殖效率。當6-BA的濃度增大時，不定芽的誘導率有所降低，同時誘導愈傷組織發生。孫倩婷[9]和呂朝萍[10]利用大花六道木的葉片和莖段培養誘導愈傷組織發生，但是愈傷只能分化產生大量根狀物，無法誘導不定芽或體細胞胚再生。本試驗中誘導形成的愈傷組織同樣沒有再生能力，無法誘導不定芽再生。近年來研究表明，多能愈傷的細胞學屬性類似于根源基細胞[12]，并非所有的植物體細胞都能被誘導產生愈傷組織,它只來源于特定類型的再生潛能細胞[13]。因此，采用合適的外植體是誘導愈傷發生的關鍵，關于大花六道木多能愈傷的誘導和分化需進一步探索研究。

6-BA和KT都是人工合成的細胞分裂素，本研究發現6-BA在誘導六道木器官再生中的效果優于KT，在添加KT的培養基上無法實現大花六道木的葉片進行脫分化。在植物組織培養中，一般需要生長素和細胞分裂素配合使用，才能誘導植株再生。而本試驗在誘導培養基中添加6-BA 的同時，加入低濃度的生長素NAA后，不定芽的誘導反而受到抑制，并促進愈傷組織的形成，表明NAA抑制大花六道木直接不定芽再生。

3.2 大花六道木生根的影響因子

將不定芽從增殖培養基轉到生根培養基時，由于細胞分裂素的殘留效果，阻礙了不定根原基的發生，因此必須提高外源生長素和細胞分裂素的比例，在生根培養基中添加一定濃度的生長素是誘導生根的重要因素。從試驗結果來看，沒有添加任何激素的培養基上生根率只有約10%，同時添加生長素IBA和NAA可有效促進大花六道木生根。本研究發現蔗糖對生根的影響較大，蔗糖的作用除了為植物生長提供碳源外，還起到調節培養基滲透壓的作用[14]，適當降低蔗糖的濃度有利于大花六道木不定根的發生。

致謝:上海市延安中學的朱心毅同學在試驗材料培養和數據統計方面參與了部分工作，在此表示感謝。