抑制素免疫對崇明白山羊超數排卵效果的影響

葛 雷，吳彩鳳，戴建軍*，李 垚，呂玉華，陳 曉，張樹山，張德福

(1上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306；2上海市農業科學院畜牧獸醫研究所，上海 201106；3上海市農業遺傳育種重點實驗室動物遺傳工程研究室，上海 201106；4上海交通大學醫學院，上海200025)

抑制素(INH)是一種由動物性腺分泌的糖蛋白激素，能特異性作用于垂體，對基礎的卵泡刺激素(FSH)分泌和促性腺激素釋放激素(GnRH)刺激的FSH分泌具有抑制作用，且呈劑量依賴關系[1-2]。抑制素免疫是一種新型可增強動物繁殖性能的方法，其通過抑制素抗體與體內抑制素進行中和反應，從而降低抑制素對FSH分泌的抑制作用，進而提高動物體內FSH激素水平、促進排卵和提高胚胎質量[3-4]。抑制素免疫在羊上的研究主要集中在對排卵及產仔數的影響[5]，其對超數排卵(簡稱超排)影響的研究未見報道。本試驗采用抑制素主動免疫配合常規超排方法，研究其對崇明白山羊的超排效果和激素水平的影響，以期提高超排效果，增加排卵點數量。

1 材料與方法

1.1 動物和藥品

選擇健康且發情周期正常的崇明白山羊，隨機分為試驗組和對照組，每組10頭。試驗組免疫制劑為含重組抑制素蛋白的油乳劑(江蘇省農業科學院施振旦教授饋贈)。CIDR(陰道栓)購自新西蘭，卵泡刺激素(FSH)、氯前列烯醇(PGF2α)和促黃體生成素(LH)均為寧波市三生藥業有限公司產品。

1.2 抑制素免疫處理

試驗組處理時，對選定的崇明白山羊臀部肌肉注射含重組抑制素蛋白的油乳劑，劑量為1 mL頭，抑制素蛋白質量濃度為1 mgmL，免疫當天記為INH 1d。INH 21d按相同劑量對崇明白山羊進行二免處理。對照組注射不含重組抑制素蛋白的油乳劑，注射劑量、時間、頻次和部位與試驗組相同。

1.3 超數排卵和同期發情處理

于INH 21d(即加強免疫當天)對試驗組和對照組羊埋植CIDR，INH 28d更換CIDR。INH 32d開始采用FSH三日遞減法進行超數排卵處理，每天6：00和18：00各進行一次FSH肌肉注射。INH 34d上午6：00注射FSH后再注射PGF2α，同時撤出CIDR。INH 35d肌肉注射LH抑制素免疫、超數排卵方法及激素用量見表1。根據發情情況，選擇合適發情時間與公羊自然交配。配種后48 h進行輸卵管手術沖胚。

表1 抑制素免疫、超數排卵方法和激素用量

1.4 血清采集

于INH 31d、INH 39d頸靜脈采血，另外在超排期間每隔6 h頸靜脈采血一次。血液靜置6 h后4 000 rmin離心15 min，收集血清，-80℃保存待測。

1.5 手術沖胚和排卵點觀察

配種后48 h進行手術沖胚和胚胎收集。手術前禁飼禁水12 h，全身麻醉后前低后高仰臥保定，乳房前腹中線開口，常規方法打開腹腔，暴露子宮、卵巢和輸卵管，記錄排卵點數目。采用TCM199+5% FBS(胎牛血清)分別于兩側輸卵管沖胚，靜置后于顯微鏡下收集胚胎，記錄每側輸卵管的胚胎數。

1.6 激素水平檢測

血清中FSH、LH、抗繆勒管激素(AMH)激素水平測定按照上海潤裕生物科技有限公司所生產的ELISA試劑盒說明書進行，孕酮(P4)和雌二醇(E2)水平測定按照Cayman Chemical Company(USA)生產的ELISA試劑盒說明書進行。

1.7 統計分析

利用SPSS 20.0軟件對排卵點、沖胚數及激素水平進行均數檢驗，結果以“均值±標準誤”的形式表示，P<0.05或P<0.01表明差異顯著或極顯著。

2 結果與分析

2.1 排卵點和沖胚數

試驗組的單側卵巢排卵點個數和單側輸卵管的沖胚數分別為11.69±1.40和9.88±1.64，均極顯著高于對照組的8.20±1.44和6.92±1.62。

2.2 抑制素免疫對超數排卵崇明白山羊血清FSH和LH分泌的影響

從圖1可以看出，抑制素主動免疫崇明白山羊可以顯著提高其體內FSH水平。在FSH注射之前的INH 31d，試驗組血清中FSH濃度與對照組有顯著差異。在超排期間，試驗組FSH水平顯著高于對照組。發情時，試驗組和對照組動物FSH水平均大幅升高，且試驗組亦極顯著高于對照組。INH 39d時，試驗組和對照組血清中FSH水平開始下降，且兩者之間沒有顯著差異。

從圖2可以看出，抑制素主動免疫崇明白山羊對其LH的分泌沒有顯著影響。發情時，試驗組和對照組LH水平有大幅升高，但無顯著差異。INH 39d時，試驗組和對照組血清中LH水平急劇下降，且兩者間無顯著差異。

*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)；虛線部分表示未按每隔6 h進行血樣采集和激素檢測，下同圖1 超排時血清FSH濃度的變化 Fig.1 Changes of serum FSH concentration in goats during superovulation

圖2 超排時血清LH濃度的變化 Fig.2 Changes of serum LH concentrations in goats during superovulating

2.3 抑制素免疫對超數排卵崇明白山羊血清AMH分泌的影響

從圖3可以看出，抑制素主動免疫崇明白山羊對其AMH分泌有短時間的影響。INH 31d和INH 33d時，試驗組AMH水平顯著高于對照組，其余時間點試驗組較對照組高，但并無顯著差異。

2.4 抑制素免疫對超數排卵崇明白山羊血清P4和E2水平的影響

從圖4可以看出，PGF2α注射后，試驗組和對照組血清P4水平均急劇下降。INH 34d時，試驗組的P4水平顯著低于對照組，其余時間無顯著差異。INH 39d時，試驗組和對照組P4水平有緩慢上升趨勢，但兩者無顯著差異。

圖3 超排時血清AMH濃度的變化Fig.3 Changes of serum AMH concentrations in goats during superovulation

圖4 超排時血清P4濃度的變化 Fig.4 Changes of serum progesterone concentrations in goats during superovulation

從圖5可以看出，抑制素主動免疫崇明白山羊對其E2的分泌沒有顯著影響。INH 36d時，E2水平迅速上升，兩組之間無顯著差異。INH 39d呈緩慢下降趨勢，兩組間亦無顯著差異。

圖5 超排時血清E2濃度的變化 Fig.5 Changes of serum oestradiol concentrations in goats during superovulation

3 討論與結論

抑制素是一種性腺分泌的糖蛋白激素，主要來源于睪丸支持細胞和卵巢顆粒細胞，其主要生理作用是與激活素共同調控FSH的合成和分泌[6]。抑制素還可以通過其他如自分泌或旁分泌途徑對性腺發揮局部影響作用，如優勢卵泡可以通過旁分泌作用對周圍卵泡產生抑制效果，從而使非優勢卵泡發生卵泡閉鎖[2]。

抑制素免疫是利用抑制素抗體免疫中和體內內源性抑制素，從而解除抑制素對FSH分泌的抑制作用，提高FSH水平，刺激未成熟卵泡發育。大量研究表明，抑制素免疫可以顯著提高動物體內FSH激素水平，增加大卵泡數量，提高排卵率，從而提高動物繁殖能力[7-9]。而超數排卵技術可以誘導大量卵泡成熟排卵，增加可移植胚胎數，在家畜胚胎移植方面具有重要意義。抑制素免疫技術和超排技術均可以通過增加動物卵泡數量和提高排卵率來提高動物繁殖力，但兩者結合使用的研究較少，目前僅在提高牛超排效果中有抑制素免疫的相關報道。覃廣勝等[3]在水牛和桑潤滋等[10]在荷斯坦母牛與西雜青年母牛上的研究發現，抑制素免疫結合超排可以提高牛的胚胎數和可用胚胎數。本試驗也發現抑制素免疫能有效地抑制崇明白山羊體內內源性抑制素的活性，并持續、顯著提高崇明白山羊超排期間的FSH激素水平，刺激未成熟卵泡發育，從而極顯著增加排卵點個數和沖胚數，提高超排效果。

AMH作為一種可以評價人類卵巢狀態的標記物，其水平可以預測卵巢狀態和超排效果[11-13]。畢江華等[14]發現牛AMH濃度越高，超排效果越好，故AMH可作為臨床預測動物卵巢狀態、評價超排效果的指標之一。在抑制素免疫相關研究中，并未見關于AMH激素水平的研究。本試驗通過檢測AMH水平發現，抑制素免疫結合常規超排技術可以顯著提高崇明白山羊體內AMH水平，此結果與排卵點數量增加相符，且能反映抑制素免疫可以增強超排效果。

抑制素免疫對其他激素如LH、P4、E2的影響仍存在爭議。部分研究者認為抑制素免疫可以提高或降低動物體內LH激素水平[4,15]，但也有研究表明抑制素免疫并不會影響LH激素水平，僅會誘導提前出現LH峰，即免疫動物會提前排卵，但提前幅度較小[9,16-17]。本試驗發現抑制素免疫并不會影響崇明白山羊體內LH激素水平，且并未出現LH提前升高的現象，這與桑潤滋等在牛超排上的研究結果相一致[10]。由于LH對抑制素的敏感程度較FSH低，且合成相對較慢，同時超排時LH上升期較長，故不能觀察到免疫動物LH提前升高。大部分研究發現抑制素免疫對動物發情期的P4水平沒有影響，其主要影響體現在黃體期(即排卵后7d左右)免疫組P4水平會顯著高于非免疫組[9,17-18]。本試驗發現，試驗組和對照組血清中P4水平均在PGF2α注射后迅速下降，且兩組激素水平整體上無顯著差異，僅在PGF2α注射時間點上試驗組顯著低于對照組，分析原因可能是由于超排時大量激素注射導致內分泌失調。故抑制素免疫對超排期間動物體內P4水平并無顯著影響。E2水平能反映動物卵巢功能情況，較高的E2水平反映動物良好的受孕能力。抑制素免疫對E2激素水平的影響對不同動物而言存在差異，奶牛、山羊等動物上的研究發現其可以提高E2水平[18-20]，但對小鼠并沒有顯著影響[21]。FSH水平會影響E2水平的變化，本試驗發現，隨著FSH激素水平的上升，E2水平也顯著升高，并未發現試驗組和對照組之間E2水平有顯著差異。桑潤滋等[10]在類似試驗中也并沒有發現抑制素免疫結合超排能對牛體內E2水平產生影響。

本研究發現，在崇明白山羊的超數排卵過程中使用抑制素免疫能顯著提高崇明白山羊FSH和AMH的激素水平，增加排卵點數目和手術后的沖胚數，達到有效提高超排的效果。