超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法研究噻蟲(chóng)嗪在雙孢蘑菇中的殘留動(dòng)態(tài)及安全性評(píng)估

張 栩，王偉民，董茂鋒，溫廣月，劉福光

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)藥安全評(píng)價(jià)研究中心，上海 201106)

噻蟲(chóng)嗪是一種全新結(jié)構(gòu)的第二代煙堿類(lèi)高效低毒殺蟲(chóng)劑，對(duì)害蟲(chóng)具有胃毒、觸殺及內(nèi)吸活性，可有效防治各種蚜蟲(chóng)、葉蟬、飛虱類(lèi)、粉虱、線(xiàn)蟲(chóng)、潛夜蛾以及多種地下害蟲(chóng)，并且與吡蟲(chóng)啉、啶蟲(chóng)脒等農(nóng)藥無(wú)交互抗性，被廣泛用于農(nóng)作物莖葉處理、種子處理和土壤處理等。噻蟲(chóng)嗪可選擇性抑制昆蟲(chóng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)煙酸乙酰膽堿酯酶受體，進(jìn)而阻斷昆蟲(chóng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常傳導(dǎo)，使害蟲(chóng)麻痹及死亡，對(duì)水生生物、鳥(niǎo)禽、土壤微生物基本無(wú)毒。但有證據(jù)顯示，新煙堿類(lèi)農(nóng)藥對(duì)蜜蜂等授粉昆蟲(chóng)生存造成威脅，并導(dǎo)致蜜蜂種群數(shù)量和聚居地減少[1]。隨著歐盟在2013年5月對(duì)3種新煙堿類(lèi)種子處理農(nóng)藥采取限制使用法規(guī)的實(shí)施[2]，噻蟲(chóng)嗪農(nóng)藥使用的健康風(fēng)險(xiǎn)和生態(tài)安全性問(wèn)題受到了越來(lái)越多的關(guān)注。

雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)又稱(chēng)白蘑菇、蘑菇、洋蘑菇，有“世界菇”之稱(chēng)，其菌絲還可作為制藥的原料。雙孢蘑菇在中國(guó)被廣泛栽培，栽培方式有菇房栽培、大棚架式栽培和大棚畦栽等。不同地區(qū)、不同氣候條件和不同季節(jié)可采取適合的栽培方式，在培育中主要使用吡蟲(chóng)啉、噻蟲(chóng)嗪等農(nóng)藥進(jìn)行害蟲(chóng)防治。

目前，對(duì)噻蟲(chóng)嗪殘留行為的研究主要集中于噻蟲(chóng)嗪在蔬菜、水果及土壤中的殘留上[3-7]，而對(duì)噻蟲(chóng)嗪在食用菌中殘留的研究很少。對(duì)噻蟲(chóng)嗪殘留的檢測(cè)方法主要有毛細(xì)管電泳[8]、液相色譜[9]、液質(zhì)聯(lián)用[10-11]等，這些方法提取、凈化步驟較多，比較繁瑣費(fèi)時(shí)，消耗有機(jī)溶劑。本試驗(yàn)擬采用乙腈溶解和分散固相萃取凈化的方法，一步完成噻蟲(chóng)嗪的提取凈化，并與超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法 (ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS)配合檢測(cè)，減少溶劑使用量，以建立一種簡(jiǎn)單且靈敏的方法測(cè)定雙孢蘑菇和土壤中噻蟲(chóng)嗪的殘留。同時(shí)，研究在雙孢蘑菇栽培中使用25%噻蟲(chóng)嗪水分散粒劑后，子實(shí)體中噻蟲(chóng)嗪殘留動(dòng)態(tài)和最終殘留，評(píng)估噻蟲(chóng)嗪殘留的安全性，為今后噻蟲(chóng)嗪在食用菌栽培中的合理使用以及制定噻蟲(chóng)嗪在雙孢蘑菇中最大殘留限量(maximum residue limit，MRL)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料1.1 供試菌株及培養(yǎng)料

雙孢蘑菇1640菌種由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所提供。

培養(yǎng)料：選擇無(wú)農(nóng)藥污染的供試培養(yǎng)料，試驗(yàn)前檢測(cè)農(nóng)藥殘留。稻草2 500 kg、菜籽餅200 kg、尿素25 kg、硫酸銨25 kg、過(guò)磷酸鈣50 kg、石膏62.5 kg、石灰75 kg。

1.2 主要藥劑與儀器

25%噻蟲(chóng)嗪水分散粒劑(東莞市瑞德豐生物科技有限公司)；噻蟲(chóng)嗪標(biāo)樣(100 mgL)，上海市農(nóng)藥研究所有限公司提供。甲醇(色譜純，美國(guó)Merck公司)；乙腈(色譜純，美國(guó)Merck公司公司)；無(wú)水硫酸鎂MgSO4(分析純)；N-丙基乙二胺(PSA)吸附劑：粒徑40—60 μm；十八烷基硅烷(ODS)鍵合相吸附劑(C18)：粒徑40—60 μm。 LC-8030高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(配電噴霧離子源，LC-MS 8030,日本島津公司)；EC-C18色譜柱(100 mm×3.0 mm,2.7 μm,美國(guó)Agilent公司)；超聲儀(中國(guó)Dragonlab公司)；離心機(jī)(Thermo-Fisher)。

1.2 雙孢蘑菇田間試驗(yàn)

1.2.1 雙孢蘑菇栽培方法

試驗(yàn)在上海市青浦區(qū)食用菌基地進(jìn)行，雙孢蘑菇采用棚架覆土栽培，培養(yǎng)料經(jīng)過(guò)二次發(fā)酵后施用。栽培方法參照李可等[12-13]，小區(qū)面積30 m2。

1.2.2 消解試驗(yàn)樣品制備

1.2.3 最終殘留試驗(yàn)樣品制備

1.3 分析檢測(cè)方法

1.3.1 樣品提取與凈化

稱(chēng)取5.00 g試樣于50 mL聚乙烯離心管中，加入20 mL乙腈溶液，分別渦旋提取和超聲提取5 min；再加入2—3 g氯化鈉，渦旋0.5 min,4 000 rmin離心5 min后，取1 mL上清液至分別稱(chēng)有50 mg PSA、150 mg MgSO4、50 mg C18的2 mL離心管中；將離心管渦旋1 min，10 000 rmin離心2 min；取上清夜過(guò)0.2 μm有機(jī)相濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

1.3.2 儀器檢測(cè)條件

1.3.2.1 液相色譜條件

1.3.2.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源 ESI；掃描方式：正離子源；毛細(xì)管電壓：3.00 kV；錐孔電壓：噻蟲(chóng)嗪20 V；噻蟲(chóng)胺16 V；離子源溫度：110℃；脫溶劑溫度：350℃；氮吹氣流量：800 Lh；錐孔氣流量：50 Lh；檢測(cè)方式：多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作

1.3.4 添加回收率與檢出限測(cè)定方法

1.4 安全性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

農(nóng)藥的膳食暴露和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估常采用食品中農(nóng)藥殘留量乘以該食品的消費(fèi)量，求得農(nóng)藥殘留攝入量與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估參照劑量(ADI或ARfD)的比較值農(nóng)藥膳食風(fēng)險(xiǎn)墑值RQ(risk quotient)評(píng)估[14]，計(jì)算公式如下：

RQ=∑[STMRi×Fi]×100[ARfD(ADI)×BW]

(1)

式中：STMRi為第i類(lèi)初級(jí)食用農(nóng)產(chǎn)品的規(guī)范試驗(yàn)殘留中值,單位 mgkg；Fi(food consumption)為第i類(lèi)食用農(nóng)產(chǎn)品的消費(fèi)量,單位 mgd；BW(body weight)為人群平均體重,單位 kg；ARfD(acute reference dose)為急性參考劑量,單位 mg(kg·BW)；ADI(acceptable daily intake)為每日允許攝入量,單位mg(kg·BW)。

當(dāng)RQ≤1 時(shí)，表示其急性風(fēng)險(xiǎn)為可接受，RQ越小，風(fēng)險(xiǎn)越小；當(dāng)RQ>1 時(shí)，表示不可接受。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

噻蟲(chóng)嗪標(biāo)準(zhǔn)品甲醇混合標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖1。噻蟲(chóng)嗪標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為：y= 1E+07x-51 846，相關(guān)系數(shù)R2=0.9993。

2.2 添加回收率與檢出限

三種濃度的噻蟲(chóng)嗪平均回收率分別為89%、102%、103%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為8%、6%、7%，在農(nóng)藥殘留分析允許范圍之內(nèi)。雙孢蘑菇中噻蟲(chóng)嗪農(nóng)藥的最低檢出限為0.01 mgkg。

2.3 殘留消解動(dòng)態(tài)

試驗(yàn)結(jié)果表明，噻蟲(chóng)嗪消解動(dòng)態(tài)按制劑量0.075 g a.i.m2施藥后，在雙孢蘑菇中的降解基本符合一級(jí)指數(shù)降解曲線(xiàn)y=0.3875e-0.123x,R2=0.9164(圖2)。隨著時(shí)間的推移，殘留量持續(xù)減少，施藥后第5天，噻蟲(chóng)嗪殘留減少36%以上，施藥后第7天，噻蟲(chóng)嗪降解率達(dá)到了60%以上,施藥后第14天，降解率達(dá)到了80%以上。根據(jù)一級(jí)指數(shù)降階曲線(xiàn)計(jì)算，噻蟲(chóng)嗪在雙孢蘑菇中的平均半衰期為6.3 d。

圖1 噻蟲(chóng)嗪標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 The standard curve of thiamethoxam

圖2 雙孢蘑菇中噻蟲(chóng)嗪殘留的降解動(dòng)態(tài)Fig.2 The degradation dynamis of thiamethoxam residuesin Agaricus bisporus

2.4 噻蟲(chóng)嗪在雙孢蘑菇中的最終殘留量

末次施藥后7 d、10 d、14 d時(shí)噻蟲(chóng)嗪在雙孢蘑菇中的最終殘留量為0.038—0.423 mgkg。我國(guó)尚未制定噻蟲(chóng)嗪在雙孢蘑菇中的最大殘留限量MRL值，本試驗(yàn)推薦噻蟲(chóng)嗪在雙孢蘑菇中的MRL值為0.5 mgkg，安全間隔期為7d。

表1 噻蟲(chóng)嗪在雙孢蘑菇中的最終殘留量

2.5 最終殘留量的長(zhǎng)期膳食攝入和慢性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

規(guī)范殘留試驗(yàn)雙孢蘑菇中噻蟲(chóng)嗪的殘留中值是0.423 mgkg 。我國(guó)《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》(GB 2763—2016)中制定噻蟲(chóng)嗪的ADI值為0.02 mg(kg·BW)[15]。參照2016版《中國(guó)居民膳食指南》，我國(guó)人均膳食結(jié)構(gòu)中淺色蔬菜的每日攝人量，成年人一般為150—250 g，我國(guó)居民的平均體重為63 kg。根據(jù)1.4中公式計(jì)算普通人群噻蟲(chóng)嗪的每日攝入量為0.0001679 mg(kg·BW)，占日允許攝入量的0.8%左右，風(fēng)險(xiǎn)商值RQ小于1，認(rèn)為該農(nóng)藥殘留對(duì)一般人群健康的影響在一個(gè)可接受的風(fēng)險(xiǎn)水平。

3 結(jié)論

噻蟲(chóng)嗪是一種全新結(jié)構(gòu)的第二代煙堿類(lèi)農(nóng)藥，可防治雙孢蘑菇中蚊蠅類(lèi)和蚜類(lèi)等害蟲(chóng)，具有更高的活性、更好的安全性、更廣的殺蟲(chóng)譜及作用速度快、持效期長(zhǎng)等特點(diǎn)，是有機(jī)磷類(lèi)和有機(jī)氯類(lèi)農(nóng)藥較好的替代品。本試驗(yàn)采用乙腈溶解和分散固相萃取凈化的方法,結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定雙孢蘑菇中噻蟲(chóng)嗪殘留含量，在0.01—0.10 mgkg添加范圍內(nèi)，平均回收率均大于89%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于8%，符合農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則的要求。噻蟲(chóng)嗪消解動(dòng)態(tài)按制劑量0.075 g a.i.m2施藥后，噻蟲(chóng)嗪在雙孢蘑菇中的平均半衰期為6.3 d。本試驗(yàn)研究了不同采收間隔期7 d、10 d、14d時(shí)噻蟲(chóng)嗪在雙孢蘑菇中的最終殘留量，殘留范圍為0.038—0.423 mgkg。噻蟲(chóng)嗪在雙孢蘑菇中的MRL值我國(guó)尚未制定，根據(jù)試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果，推薦噻蟲(chóng)嗪在雙孢蘑菇中的MRL值為0.5 mgkg，安全間隔期為7d。

本研究顯示，根據(jù)試驗(yàn)中噻蟲(chóng)嗪的殘留中值計(jì)算普通人群噻蟲(chóng)嗪的每日攝入量為0.0001679 mg(kg·BW)，占日允許攝入量的0.8%左右,認(rèn)為該農(nóng)藥殘留對(duì)一般人群健康的影響在一個(gè)可接受的風(fēng)險(xiǎn)水平。由于膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估還存在一些不確定的因素，蘑菇中噻蟲(chóng)嗪的應(yīng)用沒(méi)有登記資料數(shù)據(jù)，我國(guó)也沒(méi)有國(guó)家最大殘留限量MRL標(biāo)準(zhǔn)，因此，其膳食風(fēng)險(xiǎn)性還需進(jìn)一步確定。