不同鮮食葡萄品種的高溫逆境應答反應研究

查 倩，奚曉軍，和雅妮，蔣愛麗

(上海市農業科學院林木果樹研究所，上海 201403)

溫度是影響葡萄生長發育和產量品質的主要因子，夏季持續的高溫環境會影響葡萄植株生長和果實發育，表現為葉片卷曲失水干枯，果實出現較為嚴重的日灼[1]，造成不可逆的經濟損失。

高溫逆境會破壞植物體內活性氧的平衡狀態，屬于氧化還原脅迫[2-4]。植物往往通過提高抗氧化酶活性，減少自由基的傷害，來應答逆境[5-6]。超氧化物歧化酶(SOD)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)和過氧化氫酶(CAT)等均參與植物抗氧化反應[7]，大多數植物SOD、POD(過氧化物酶)、CAT的酶活性在高溫下表現出增多現象[8-9]，并且高溫會導致植物組織中的丙二醛(MDA)等有害物質增多[10]。

此外，高溫逆境下植物會產生一系列生理生化過程，其中光合作用最為敏感[11]，研究表明高溫處理會破壞PS II光化學系統，尤其表現在抑制植物光合電子傳遞，降低葉片光化學效率，導致植物不能有效利用吸收的光能，最終破壞光合中心機構[12-15]。高溫脅迫誘發有機體合成一系列熱激蛋白HSPs，其中分子量為15—30 ku的蛋白是sHSPs，會參與保護PS II光化學反應[16-17]。目前，sHSPs蛋白與植物耐熱性相關研究較多[18-19]。

孫軍利等[20]研究認為葡萄高溫逆境與氧化還原平衡關系密切，Luo等[21]發現葡萄葉片的光合作用受溫度影響顯著。我國南方地區主要種植歐美雜種系葡萄品種，并常出現40 ℃以上極端高溫天氣，不同葡萄品種在高溫逆境下的差異應答反應的比較目前還沒有報道。為了探明不同遺傳背景葡萄品種的高溫應答過程，本研究開展了歐美雜種系葡萄高溫逆境應答反應研究，以便為南方地區葡萄產業的健康發展提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設計

試驗于2014年12月—2015年10月在上海市農業科學院進行。葡萄品種有‘巨峰’‘巨玫瑰’‘醉金香’‘夏黑’‘申豐’‘申華’和‘滬培1號’，均屬于歐美雜交品種(V.Vinifera×V.LabruscaL.)。

將一年生盆栽葡萄扦插苗種植于直徑30 cm、高度40 cm的塑料盆內，培養介質為椰糠∶腐殖土 = 1∶1。試驗在智能人工氣候培養箱(PRX-1000C，杭州錢江儀器設備有限公司)中進行，設定白夜持續時間分別為14 h10 h，相對濕度保持在65%—70%，白夜溫度保持在(25±1) ℃(20±1) ℃，光合有效輻射為 200 μmol·m-2·s-1。

待植株長至20—25片功能葉完全展開時進行25 ℃、35 ℃、45 ℃溫度處理，設置處理時間為每天的10：00—16：00，其他時間段(白夜)溫度保持(25±1) ℃(20±1) ℃。每個小區選5株葡萄，設置3個小區。不同溫度梯度分別處理3 h、6 h及150 h后，選第7—9片功能葉進行無損傷的葉綠素熒光測定，重復10次，并取葉片凍存在-70 ℃超低溫冰箱內，用于SOD活性、MDA含量和HSP21蛋白表達的檢測，重復3次。

1.2 測定方法

1.2.1 抗氧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量測定

超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用氮藍四唑NBT法[22]；丙二醛(MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸TBA顯色法[23]。

1.2.2 葉綠素熒光參數的測定

利用連續激發式熒光儀(Pocket PEA，Hansatech，英國)無損傷測定葡萄葉片葉綠素快相熒光動力學參數，測定前進行20min暗適應處理，OJIP曲線由3 000 μmol·m-2·s-1紅光誘導，測定時間為1s。

葉綠素熒光各參數意義：FvFm=ΦPo為PSII光化學反應中最大光化學效率；PIABS為以吸收光能為基礎的性能指數；ΨEo為反應中心捕獲的激子中用來推動電子傳遞時到電子傳遞鏈中超過QA的其他電子受體的激子占用來推動QA還原激子的比率；ΦEo為用于電子傳遞的量子產額；Wk為K相可變熒光占J相可變熒光的比例；RCQA為單位反應中心激活PSII反應中心的能量；δRo為電子從系統間電子傳遞體傳遞給光系統I(PS I)受體側電子受體的概率[13]。

1.2.3 HSP21蛋白表達分析

采取有機溶劑法提取蛋白質[24]，并用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。提取的20μg蛋白樣品在質量分數為12% SDS-PAGE配置膠中電泳后轉膜，封閉后加入一抗Anti-HSP21(Abcam，England，1∶3 000)[25]，4 ℃孵育過夜后加入二抗Anti-rabbit IgG(H+L)(CST，USA，1∶1 000)，室溫放置1 h后，浸于電化學發光試劑中顯色。

1.3 統計學分析

利用SPSS 15.0對數據進行統計學分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 高溫逆境下不同葡萄品種的表型變化

在25 ℃和35 ℃處理下，各品種葡萄植株生長狀態和表型較為良好。45 ℃處理6 h時‘申華’和‘夏黑’頂梢和幼嫩葉片表現出失水枯萎癥狀，但仍然有健康的功能葉片，并持續到150 h時；45 ℃處理3 h時，‘巨峰’和‘巨玫瑰’頂梢就出現失水枯萎癥狀，6 h后植株大面積的失水枯萎，150 h表現為整株干枯；‘申豐’‘醉金香’和‘滬培1號’在45 ℃處理3 h時植株葉片出現大面積失水枯萎，6 h后整株干枯。觀察表型變化可知‘申華’和‘夏黑’品種的幼樹具有較好的抗高溫性能(圖1)。

A—G為25 ℃ 處理下的‘申華’‘夏黑’‘巨峰’‘巨玫瑰’‘申豐’‘滬培1號’‘醉金香’；a—g為45 ℃處理下‘申華’‘夏黑’‘巨峰’‘巨玫瑰’‘申豐’‘滬培1號’‘醉金香’圖1 25 ℃和45 ℃處理下6 h時不同葡萄品種表型觀察Fig.1 The phenotypic observation of different grape cultivars at 6 h under 25 ℃ and 45 ℃ treatments

圖2 不同溫度處理下不同葡萄品種SOD活性變化Fig.2 The changes of SOD activity in different grapecultivars under different temperature treatments

2.2 高溫下不同葡萄品種SOD活性和MDA積累量的變化

如圖2所示，‘申華’的SOD活性在35 ℃處理6 h時增強明顯，150 h時恢復至原初水平，45 ℃處理 3 h時SOD活性最高，隨后恢復至原初水平；‘夏黑’的SOD活性在35 ℃下變化不明顯，而45 ℃處理 3—6 h時略有降低；‘巨峰’‘巨玫瑰’和‘滬培1號’在高溫下SOD活性變化均不明顯；‘申豐’和‘醉金香’在35 ℃處理SOD活性變化不大，而在45 ℃處理3 h時SOD活性較高。以上可知，高溫逆境下不同葡萄品種氧化還原平衡調節方式有所不同。

由圖3可知，‘申華’在高溫處理下(35 ℃、45 ℃)MDA含量沒有出現明顯的變化；‘夏黑’和‘巨玫瑰’在35 ℃和45 ℃處理下MDA含量均有增加的現象；‘巨峰’‘申豐’‘滬培1號’僅在45 ℃處理MDA含量增加，其中‘滬培1號’表現最為明顯；‘醉金香’在高溫處理下MDA含量變化不顯著。

圖3 不同溫度處理下不同葡萄品種MDA含量變化Fig.3 The changes of MDA in different grapecultivars under different temperature treatments

2.3 高溫對不同葡萄品種葉綠素熒光參數的影響

由圖4可知，與25 ℃處理相比，7個品種在35 ℃處理下FvFm值沒有顯著變化，但在45 ℃處理下不同品種間FvFm值的變化不同。‘申華’在45 ℃處理3 h時FvFm值下降，6 h時有所恢復，150 h時恢復至原初水平；‘夏黑’在45 ℃處理3 h和6 h時FvFm值在降低，150 h時也恢復至原初水平；‘巨峰’在45 ℃處理3 h至6 h時FvFm值持續下降；‘巨玫瑰’45 ℃處理3 h時FvFm值下降，并在6 h時恢復至原初水平；‘申豐’‘滬培1號’和‘醉金香’在高溫3 h時FvFm值都明顯下降。由上可知，45 ℃處理3 h時葡萄葉片PS II反應中心較為活躍。

圖4 不同溫度處理下不同葡萄品種FvFm值變化Fig.4 The changes of FvFm in different grape cultivars under different temperature treatments

由表1可知，35 ℃處理下不同葡萄品種的PS II活性未受到顯著影響，僅‘巨峰’的部分參數值在35 ℃處理3 h時增多，已知PIABS值由光能的吸收效率(ΦPo)、反應中心對光能的轉換效率(ΨEo)及電子傳遞效率(ΦEo)組成，說明一定程度的高溫逆境會增強‘巨峰’PS II反應中心的光能轉換效率和電子傳遞效率，除‘巨蜂’外的其他6個品種35 ℃處理的PIABS值與25 ℃處理無明顯差異。但在45 ℃處理下7個葡萄品種的PIABS值均減少，其中‘申華’‘夏黑’‘巨峰’和‘巨玫瑰’的PIABS值降至0.2—0.6，‘申豐’‘滬培1號’和‘醉金香’的PIABS值降至0.0—0.2，同時伴隨著ΦPo、ΨEo和ΦEo值的減少，說明極端高溫(45 ℃)會降低反應中心的光能吸收效率和后續過程效率。

35 ℃高溫下7個葡萄品種的Wk、δRo和RCQA值與25 ℃無明顯差異，但在45 ℃高溫下7個品種的Wk值和δRo值幾乎均顯著性增多，而RCQA值均有明顯減少，其中‘申豐’‘滬培1號’和‘醉金香’的變化幅度更大。

表1 不同溫度處理3 h時不同葡萄品種其他熒光參數比較

注：*表示一個參數在同一葡萄品種中其他溫度處理與25 ℃處理間的顯著性差異(P<0.05)

2.4 高溫逆境下抗逆蛋白HSP21表達量變化

45 ℃處理逆境響應蛋白HSP21表達的檢測見圖5，結果表明：HSP21的蛋白表達與處理時間和葡萄品種均有關系，處理3—6h，‘申華’ HSP21蛋白持續積累，6 h時最多，150 h時略有減少；‘夏黑’3 h時有較小幅度的積累，6—150 h積累量顯著減少；‘巨峰’高溫下3—6 h，蛋白積累增多；‘巨玫瑰’在3 h時蛋白積累較明顯；‘滬培1號’‘醉金香’和‘申豐’這3個品種在高溫處理后HSP21蛋白量減少明顯，這可能與不同品種的耐高溫能力差異有關。

圖5 45 ℃處理下不同葡萄品種HSP21蛋白表達Fig.5 The HSP21 levels of different grape cultivars under 45 ℃ treatment

3 討論與結論

熱害是植物對高溫逆境最為直觀的反應，本研究發現，在25 ℃、35 ℃處理下7個鮮食葡萄品種的植株形態表現均良好。45 ℃處理下不同品種表現不同，‘夏黑’和‘申華’在處理3—6 h時有失水萎蔫出現，在150 h時得到恢復，‘巨峰’和‘巨玫瑰’在處理6 h時葉片大面積失水干枯，處理3 h時‘滬培1號’‘醉金香’和‘申豐’葉片就會大面積失水直至干枯。綜上，7個品種中‘夏黑’和‘申華’在極端高溫(45 ℃)下植株的形態表現良好，‘巨峰’和‘巨玫瑰’次之，‘滬培1號’‘醉金香’和‘申豐’表現差。

高溫逆境下，植物葉片氧化脅迫加劇，MDA等有害物質含量上升，植物通過增強SOD等抗氧化酶活性，可在一定程度上清除過多的有害物質，維持膜系統的穩定性，進而保護葉片光合系統的正常運轉[26]，本研究中的葡萄SOD活性受高溫誘導增多，但不同品種表現不一致。并且，高溫逆境下‘申豐’‘滬培1號’‘醉金香’3個品種的MDA含量顯著增加，這與酶蛋白失去活性有關[27]。由上可知，高溫脅迫下SOD活性和MDA含量的變化與品種的耐熱差異性有關[28]。

高溫逆境會傷害植物的光合機構，降低植物的PSII光化學效率[29-30]。本研究表明，35 ℃高溫處理下‘巨峰’的PIABS、FvFm(ΦPo)、ΨEo和ΦEo有所增加，其他葡萄品種的葉綠素熒光參數均無明顯變化。Luo等[21]認為在35 ℃和38 ℃處理下，‘京秀’葡萄的PSII光化學效率均與對照處理沒有顯著性差異[21]。推斷在40 ℃處理下，一些葡萄品種可通過自身的耗散機制來消耗過剩能量[31]，不對葡萄葉片的光合原初反應造成影響。但是，45 ℃處理3 h即可明顯影響葡萄葉片的光化學反應PSII活性。葡萄、柑橘、甜椒等植物受到高溫脅迫后FvFm會顯著下降[32-34]，與本研究結果一致。本研究還發現，‘申華’‘夏黑’‘巨峰’和‘巨玫瑰’的ΦPo、ΨEo、ΦEo和PIABS值降幅水平顯著低于其他品種，說明這4個品種的PS II受逆境影響較小。不同葡萄品種葉片PS II的供體側指標Wk、受體側指標δRo及反應中心指標RCQA在45 ℃處理3 h時表現出顯著性差異說明PS II的供體側和受體側發生能量和電子轉移的紊亂，導致反應中心中用于激活PS II化學反應的能量減少。對‘左優紅’和‘京秀’葡萄的研究也有相同報道[21,25]。‘申豐’‘滬培1號’和‘醉金香’的Wk、δRo和RCQA值變化幅度較其他品種更為顯著，說明這3個品種的PS II光化學反應對高溫更為敏感，光合系統受到的破壞更大。

此外，‘夏黑’和‘申華’在45 ℃處理150 h后葉綠素熒光參數值和抗氧化酶活性均恢復到正常水平值，這可能與植株的耐熱潛能被激發有關，所以這2個品種表現出較強的高溫耐性。

Zha等[35]認為HSP21與高溫逆境是存在正比關系的，sHSPs蛋白參與植物葉片的PS II反應，能有效地提高植物的耐熱性[36-37]，在高溫脅迫中上調表達可能有利于保護植物葉片功能。本研究中高溫處理下‘申華’和‘巨峰’品種的HSP21蛋白水平增多，時間上表現出緩慢積累性和持續性。‘夏黑’和‘巨玫瑰’的HSP21蛋白水平在45 ℃高溫處理后表現為先增加后降低，‘滬培1號’‘醉金香’和‘申豐’的HSP21蛋白在45 ℃高溫處理3 h時降低，說明高溫處理下葉片失水嚴重，對蛋白積累也造成影響，所以不同品種應答高溫逆境是存在差異的，這些差異可能源于品種間不同的遺傳背景。

綜上可知，高溫脅迫會破壞葡萄葉片的光化學反應和氧化還原平衡，不同鮮食葡萄品種均發生不同程度高溫逆境應答反應。從植株的生長狀態、抗氧化酶活性、PS II活性等指標變化來看，7個品種對高溫逆境應答反應的穩定性較好的為‘申華’和‘夏黑’，其次是‘巨峰’和‘巨玫瑰’，‘滬培1號’‘申豐’和‘醉金香’較差。