微管蛋白、水通道蛋白4和K+通道蛋白4.1在大鼠脊髓損傷后不同時間的表達變化①

陳鐵戈，郭永強，王明，張東亮，夏亞一，汪靜，伍亞民，黨躍修，張海鴻

1.蘭州大學第二醫(yī)院骨科，甘肅蘭州市730030；2.甘肅省骨關(guān)節(jié)疾病重點實驗室，甘肅蘭州市730030；3.中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所三室，創(chuàng)傷、燒傷與復合傷國家重點實驗室，重慶市400042

脊髓損傷后恢復一直是醫(yī)學界的難點與熱點，脊髓水腫是脊髓繼發(fā)性損傷非常重要的病理生理基礎，水腫、血腫及血管的擴張使損傷后脊髓體積增加，脊髓內(nèi)壓增高，髓內(nèi)微循環(huán)障礙，加重缺血缺氧，最終導致脊髓液化壞死。

水通道蛋白4(aquaporins-4,AQP4)與K+離子通道4.1(potassium ion channel protein-4.1,Kir4.1)主要表達于星形膠質(zhì)細胞，參與損傷后水腫的形成與消散[1-3]。微管作為細胞骨架最重要的組成部分，見于所有真核細胞，其功能包括胞質(zhì)內(nèi)運輸、細胞器定位、細胞形態(tài)與運動性的維持和改變[4]。有研究表明[5]，應力作為刺激因子被細胞骨架感知，細胞骨架的改變可引起效應酶及細胞膜離子通透性發(fā)生變化。我們推測，微管作為細胞骨架重要的組成部分，可能參與脊髓損傷后AQP4和Kir4.1的表達及水腫的形成。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

90只成年雌性Sprague-Dawley大鼠，體質(zhì)量220～250 g，由蘭州大學醫(yī)學部動物中心提供。實驗前2周飼養(yǎng)于實驗室，自然晝夜采光，自由飲食飲水，室溫25℃。大鼠飼養(yǎng)及實驗過程均遵守實驗動物管理及保護的有關(guān)規(guī)定。大鼠隨機分為假手術(shù)組(n=30)和損傷組(n=60)，損傷組再分為6 h、1 d、3 d、5 d、7 d五個亞組，每個亞組12只。實驗大鼠依照實驗動物相關(guān)福利與倫理原則進行處理。

1.2 主要試劑與儀器

RM2007 Allen打擊器：美國新澤西州大學。CM1950冰凍切片機：LEICA公司。Finesse325石蠟切片機：THERMO公司。熒光顯微鏡：OLYMPUS公司。α-Tubulin：EP1332Y，ab52866，美國ABCAM公司。AQP4：BF-9104，美國AFFINIT公司。Kir4.1：12503-1-AP，美國PROTEINTECH公司。小鼠抗大鼠GAPDH單克隆抗體：美國PROTEINTECH公司。兔SP試劑盒(SP-9001)、小鼠SP試劑盒(SP-9002)：北京中杉金橋生物技術(shù)公司。RIPA裂解液：碧云天公司。無毒環(huán)保蘇木精-伊紅(HE)染劑、BCA蛋白定量測試盒、PVDF膜：北京索萊寶科技公司。ECL發(fā)光液：美國MILLOPORE公司。

1.3 模型制作

動物常規(guī)術(shù)前準備，術(shù)前禁食12 h。1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，待角膜反射消失、持針器夾持尾端無反應表明麻醉成功。背部剃毛備皮，俯臥固定于手術(shù)臺；碘伏術(shù)區(qū)皮膚消毒。兩耳尖連線偏尾側(cè)三橫指處定位T10，以T10做3 cm背部正中切口，逐層分離筋膜及椎旁肌肉組織，暴露T9～T11椎體，咬除T9～T11椎板，仔細暴露T10脊髓，注意勿傷及硬脊膜。將實驗組大鼠固定于Allen打擊器，調(diào)整打擊棒末端；使其對準T10脊髓，打擊力度20 g×2.5 cm[6]，打擊后立即移開打擊棒，打擊棒與脊髓接觸時間1 s。

打擊成功表現(xiàn)為大鼠雙下肢痙攣性抽搐后癱軟，尾巴左右擺動后下垂，被打擊部位脊髓表現(xiàn)為充血水腫。

兩組均用無菌生理鹽水沖洗傷口，逐層縫合肌肉和皮膚，用碘伏棉球擦拭手術(shù)傷口后將大鼠在復溫墊上復溫1 h后放回籠中。術(shù)后腹腔注射青霉素16萬U/d至術(shù)后3 d。按摩膀胱擠尿，每天3次至術(shù)后7 d。

1.4 脊髓含水量測定

造模后6 h、1 d、3 d、5 d、7 d，每個亞組各取3只大鼠，1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉后活取脊髓，取脊髓打擊部位上下各0.5 cm。取出后在微量天平上稱取濕重，將稱取濕重的脊髓用錫紙小心包好，放入恒溫烤箱，溫度調(diào)至80℃，烘烤48 h至恒重后取出[7]，稱取干重。

1.5 HE染色

造模后6 h、1 d、3 d、5 d、7 d，每個亞組各取3只大鼠，1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，0.01 mmol/PBS 250 ml和4%多聚甲醛200 ml經(jīng)左心室快速灌注固定。取出損傷端脊髓組織(上下各0.5 cm)6～8 mm，4%多聚甲醛固定24 h，OCT包埋劑包埋，連續(xù)切片，厚度20 μm，HE染色，光鏡下觀察。

1.6 免疫組織化學染色

造模后6 h、1 d、3 d、5 d、7 d，每個亞組取3只大鼠，上述麻醉方法麻醉后，分別用0.01%mmol/PBS 250 ml和4%多聚甲醛250 ml經(jīng)左心室灌注固定。以損傷點為中心，頭端側(cè)和尾端側(cè)各延伸0.5 cm選取脊髓，取出后放入4%多聚甲醛，4℃冰箱中固定24 h，將組織修成合適大小后放入包埋盒進行脫水，脫水后石蠟包埋，用預冷冰切機進行切片，室溫脫蠟、水化。二甲苯1號10 min，二甲苯2號8 min，二甲苯3號8 min，無水乙醇5 min，90%乙醇3 min，80%乙醇3 min，70%乙醇3 min。96～98℃檸檬酸鈉熱抗原修復，滅活內(nèi)源酶活性后滴加山羊血清封閉液，室溫封閉10 min；甩掉封閉液滴加一抗α-Tubulin(1∶200)、AQP4(1∶200)、Kir4.1(1∶200)，4 ℃冰箱孵育過夜，室溫復溫，吸棄一抗，0.01 mol/L PBS清洗3次，雙蒸水清洗3次；選取合適SP試劑盒滴加二抗，室溫孵育10 min，PBS清洗3 min×3次，雙蒸水清洗3次；滴加鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液，室溫孵育10 min，PBS清洗3 min×3次，雙蒸水清洗3次；DAB溶液染色，顯微鏡下觀察，合適后終止，蘇木素復染后清洗，鹽酸酒精分化，脫水，中性樹膠封片后顯微鏡下觀察。

1.7 Western blotting

各亞組另取大鼠3只，麻醉后活取脊髓，立即放入液氮備用。稱量組織后以1∶10加入RIPA裂解液，玻璃研磨器研磨組織后超聲碎細胞儀破碎細胞，4℃、1200 r/min離心30 min，收集上清液，加入蛋白上樣緩沖液30 μl(1/3蛋白原液)，100℃煮沸5 min。BCA試劑盒測定蛋白濃度，于-80℃冰箱保存。

行10%SDS-PAGE電泳，濃縮膠80 V/30 min，分離膠120 V/60 min，將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)至甲醛浸透的PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗滌，每次10 min，共3次；加兔抗大鼠α-Tubulin多克隆抗體 (1∶ 4000)、 AQP4 小 鼠 單 克 隆 抗 體 (1∶ 1000)、Kir4.1兔抗大鼠多克隆抗體(1∶500)、GAPDH小鼠抗大鼠單克隆抗體(1∶5000)，4℃冰箱過夜孵育。TBST洗滌，每次10 min，共3次；加辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔或抗小鼠lgG(1∶5000)，室溫下2 h；TBST洗膜10 min，共3遍；暗室曝光，滴加ECL發(fā)光液，X線膠片曝光，計算目的蛋白灰度值與內(nèi)參GAPDH蛋白灰度值之比。

1.8 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料均用(xˉ±s)表示，多組間比較均采用方差分析。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

假手術(shù)組蘇醒后即可活動，無后肢功能障礙，無血尿尿儲留，無明顯腹部脹氣，排便困難。損傷組大鼠蘇醒后精神狀態(tài)較差，雙后肢運動功能完全喪失，鉗夾尾部無反應，出現(xiàn)血尿尿儲留腹部腫脹等；部分大鼠出現(xiàn)血尿，每日按摩大鼠膀胱3次，協(xié)助其排尿。

2.2 脊髓含水量

與假手術(shù)組相比，損傷組損傷后6 h含水量即增加，3 d迅速增加，第5天達到高峰，且到第7天時略有下降(P＜0.05)。見表1。

2.3 脊髓各組HE染色

假手術(shù)組脊髓組織無損傷壞死及出血，結(jié)構(gòu)完整，灰質(zhì)白質(zhì)邊界清晰，細胞排列有序，細胞核形態(tài)正常。

損傷組急性脊髓損傷后6 h，脊髓灰質(zhì)和中央管開始出血，與白質(zhì)邊界不是很清晰，細胞間隙發(fā)生腫脹，神經(jīng)元腫脹；損傷后1 d，脊髓灰質(zhì)出血嚴重、結(jié)構(gòu)紊亂，細胞間隙腫脹較6 h明顯，神經(jīng)元較6 h相比減少，白質(zhì)也有少量出血；損傷后3 d，灰質(zhì)白質(zhì)壞死面積增大，細胞腫脹明顯，神經(jīng)元因腫脹加重發(fā)生細胞核固縮；損傷后5 d、7 d，脊髓灰白質(zhì)出血減少，結(jié)構(gòu)紊亂、壞死嚴重，有囊腔和空泡形成，神經(jīng)元和細胞水腫明顯，神經(jīng)元數(shù)量明顯減少。見圖1。

表1 各組脊髓含水量(%)

2.4 免疫組織化學染色和Western blotting

α-Tubulin在假手術(shù)組表達高于各損傷組，損傷組術(shù)后6 h與假手術(shù)組表達基本相同，1 d、3 d表達趨勢相似，但術(shù)后5 d表達明顯下降，到第7天時表達又有所回升。AQP4在假手術(shù)組脊髓組織中低度表達，主要分布于灰質(zhì)和中央管，損傷組損傷后6 h表達下降，1 d后表達略有升高，3 d后表達顯著增高，5 d時達到高峰，7 d略有下降，灰質(zhì)較白質(zhì)分布明顯，多定位于細胞膜處。Kir4.1表達趨勢與α-Tubulin相似，在假手術(shù)組表達高于各損傷組，術(shù)后6 h、1 d，Kir4.1表達略有下降，3 d表達下降較明顯，5 d表達量最低，7 d表達量又有所升高。見圖2～圖4、表2。

Western blotting表達情況同免疫組化染色。見圖5、表3。

表2 各組α-Tubulin、AQP4和Kir4.1陽性百分比(%)

圖1 各組脊髓HE染色(100×)

圖2 各組α-Tubulin免疫組織化學染色(400×)

圖3 各組AQP4免疫組織化學染色(400×)

圖4 各組Kir4.1免疫組織化學染色(400×)

圖5 各組Western blotting檢測

表3 各組α-Tubulin、AQP4和Kir4.1蛋白表達(Western blotting)

3 討論

脊髓損傷分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，繼發(fā)性損傷包括出血、水腫、炎癥及毒物的積累。其中，脊髓水腫是繼發(fā)性損傷的基礎；水腫、血腫及損傷部位血管的擴張使局部脊髓體積增加，但因硬脊膜的存在使脊髓無代償空間，導致脊髓內(nèi)壓升高，髓內(nèi)微循環(huán)障礙，缺血缺氧更加嚴重，最終導致?lián)p傷局部脊髓液化壞死[8-9]。

水通道蛋白是機體重要的水調(diào)節(jié)蛋白，且AQP4主要分布于哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)，首次由Hasegawa等[10]在大鼠肺臟中發(fā)現(xiàn)。AQP4在脊髓中主要分布于脊髓灰質(zhì)、膠質(zhì)界膜的星形膠質(zhì)細胞以及由星形膠質(zhì)終足包繞的毛細血管部[11]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，Kir4.1與AQP4的表達存在相關(guān)性[12]，主要表達于脊髓中的星形膠質(zhì)細胞。在正常生理條件下，AQP4主要調(diào)節(jié)腦脊液的形成與吸收，Kir4.1通過對K+吸收影響滲透壓，從而調(diào)節(jié)水的運輸。二者在調(diào)節(jié)水分布方面具有偶聯(lián)效應[13]。但二者在中樞神經(jīng)損傷后的表達變化不同，有研究表明，脊髓損傷后在血源性水腫期AQP4表達會暫時下降，而隨著時間推移，表達逐漸增高，原因在于血源性水腫的消散依賴AQP4，而細胞毒性水腫由AQP4導致[14]。而Oklinski等[14]、Olsen等[15]和Najafi等[16]發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷后會引起Kir4.1的廣泛性消失，最終導致脊髓水腫和脊髓空洞癥(post traumatic syringomyelia,PST)的形成，而PST被認為是脊髓內(nèi)流體的流入與流出之間不平衡導致的。

細胞骨架蛋白作為細胞的“生命之柱”，廣泛存在于真核細胞，其主要由微管、微絲和中間絲組成。微管作為細胞骨架最重要的組成部分，主要由異二聚體α和β-Tubulin組成；涉及細胞形態(tài)變化，胞內(nèi)物質(zhì)運輸及胞內(nèi)蛋白的表達[17]，同時還在組織內(nèi)環(huán)境信息與能量傳遞中起重要作用[5]。Ruschel等[18-19]發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷后α-Tubulin的表達下降，在應用微管解聚抑制劑后α-Tubulin表達增高，同時脊髓損傷大鼠后肢功能得以提高。Crunkhorn等[20]也認為穩(wěn)定重塑微管可修復脊髓損傷。Zelinski等[21]和Akhmanova等[22]認為，外力可導致微管解聚，表達下降，且隨著損傷加重表達降低。近年研究發(fā)現(xiàn)，應用微管解聚劑可調(diào)節(jié)AQP1和AQP2在大鼠腎臟主細胞胞膜上的定位[23-25]，應用秋水仙素解聚微管后，AQP1、AQP2在腎臟細胞中過表達，但對于α-Tubulin與AQP4和Kir4.1之間的關(guān)系尚無研究報道。

本研究發(fā)現(xiàn)，α-Tubulin與AQP4和Kir4.1對大鼠脊髓損傷后水腫的形成三者相互關(guān)聯(lián)。AQP4在大鼠脊髓損傷后6 h內(nèi)表達稍降低，從1 d開始表達逐漸增高，到5 d達到頂峰，于7 d稍有下降，而α-Tubulin和Kir4.1二者表達相似，即在假手術(shù)組中高表達，損傷后6 h表達略有下降，且在5 d表達最低，7 d表達略有回升。可以看出α-Tubulin與Kir4.1表達呈正相關(guān)，與AQP4表達呈負相關(guān)，且與脊髓損傷后脊髓含水量的形成相反。我們推測外力損傷作為機械刺激因子導致微管細胞骨架解聚降解，而微管的解聚擾亂正常細胞內(nèi)環(huán)境，導致胞內(nèi)蛋白表達和包膜蛋白定位發(fā)生改變，從而引起內(nèi)環(huán)境變化。

本研究證實，外力引起脊髓損傷時機械刺激因子導致微管解聚，作為胞內(nèi)蛋白運輸通道的微管斷裂降解可能導致離子通道Kir4.1的表達下降和膜蛋白AQP4在胞膜的定位增加，從而導致水腫。

目前，針對脊髓損傷后水腫的治療尚無切實有效的辦法，甲潑尼龍因其嚴重的副作用現(xiàn)已被禁止用于脊髓損傷后的臨床治療[26]。我們推測，利用大鼠脊髓損傷后給予微管細胞骨架解聚抑制劑和微管聚合抑制劑，可進行進一步觀察三者的表達變化關(guān)系，探究損傷后脊髓水腫的原因。