URI在胃癌組織的表達及對順鉑誘導的胃癌細胞凋亡的影響

卞慧琴，谷雨，2，陳瑾楠，王倩，呂耀娟，鄭其平，谷俊俠

（1.江蘇大學醫學院，江蘇鎮江212013；2.江蘇大學附屬人民醫院血液科，江蘇鎮江212001）

胃癌是全球高發的惡性腫瘤，據統計，2013年全球約有84萬人死于胃癌，其中發展中國家占77%，且主要集中于中國［1-2］。胃癌確診時很多已屬中晚期，主要采用手術聯合化療進行治療。由于化療耐藥的產生，患者術后復發和轉移率高，預后不良［3］。前折疊素家族（PDFs）的非傳統成員非經典前折疊素RPB5相互作用因子（unconventional prefoldin RPB5 interactor，URI）是一個多功能蛋白，影響細胞的多種生物學行為，如真核基因轉錄及哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）營養敏感通路的調控、維持基因組DNA穩定性等［4-7］。近年發現 URI具有癌基因的特性［8-11］。我們前期的體外實驗證實URI能促進胃癌細胞的增殖與遷移，增強對多柔比星的耐藥性，促進腫瘤細胞存活［12］。這提示URI在胃癌細胞中起癌蛋白的作用。一個原癌基因是否在某種腫瘤中發揮作用，需要有該基因在腫瘤組織中擴增或突變的依據。URI在胃癌組織中是否擴增及過度表達目前并不清楚。本研究應用胃癌組織芯片檢測了胃癌組織URI的表達并分析其與臨床特征的相關性，并通過體外實驗分析URI對順鉑誘導的胃癌細胞凋亡的影響，以探討URI在胃癌發生發展中的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織芯片及細胞株 胃癌生存期組織芯片（HStm-Ade180Sur-09）購自上海芯超生物科技有限公司。芯片包含90例手術切除病理確診為胃癌患者的組織標本，包括胃腺癌84例，其中黏液腺癌3例，腺癌中含部分印戒細胞癌5例，腺癌中含部分黏液腺癌2例；印戒細胞癌5例，其中伴部分黏液腺癌1例；高級別上皮內瘤、癌變1例（此例為瘤和癌都含有的病例，取樣點經病理確認為癌變組織）。每例癌和癌旁組織各一個點，共180個點。

90例患者術前均未接受化療放療，其中男67例，女21例，年齡44～86歲，平均年齡67.3歲。病理分級：Ⅰ、Ⅱ級28例，Ⅲ級61例；腫瘤直徑：＞5 cm 47例，≤5 cm 40例；胃癌轉移64例，未發生轉移24例；TNM分期：TNM1、TNM2共33例，TNM3、TNM4共48例；手術時間在2009年12月至2010年6月，隨訪至2016年6月，隨訪期間死亡病例60例，生存病例30例；其中缺失的病例為資料不詳的病例。

人胃癌細胞株MGC-803和SGC-7901由江蘇大學朱偉教授贈予。

1.1.2 主要試劑及儀器 DMEM培養基（美國Hyclone公司）；胎牛血清（以色列 BI公司）；兔抗人URI單克隆抗體（美國 Proteintech公司）；小鼠／兔IgG-SABC免疫組化染色試劑盒（SA 1020）、DAB顯色試劑盒（AR1022）和 Mayor's蘇木素（AR0005）購自武漢博士德生物公司；Hiperfect轉染試劑（美國QIAGEN公司）；URI siRNA-A片段（前期從siRNAA、siRNA-B、siRNA-C中篩選出來的干擾效果最好的片段）、無關序列片段（蘇州吉瑪公司）；順鉑（美國Selleckchem公司）；流式細胞儀、FITC Annexin-V凋亡檢測試劑盒（美國BD公司）；兔抗人GAPDH抗體（蘇州睿瀛公司）；HRP標記羊抗兔IgG（美國CST公司）；熒光定量PCR試劑盒、熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）；凝膠成像系統（Gene公司）。

1.2 方法

1.2.1 組織芯片URI檢測 采用辣根過氧化物酶法進行組織芯片免疫化學染色，主要步驟：60℃烤片；二甲苯及梯度乙醇脫蠟；枸櫞酸鹽緩沖液熱修復；3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶；5%BSA封閉液37℃濕盒封閉；4℃濕盒一抗孵育過夜；37℃濕盒二抗孵育；SABC放大；DAB顯色，見明顯棕色即終止；蘇木素復染；脫水；中性樹脂立即封片。

組織芯片中URI的表達量由病理學專家在未知URI蛋白性質的情況下盲法進行鏡檢分析獲得，高倍鏡（400×）下每個組織點隨機選取5個視野計數目標細胞并評分，胃癌組織中選取上皮組織癌細胞計數，癌旁組織中選取正常上皮和良性腺瘤細胞計數，分別判讀URI的胞質、胞核染色的染色強度和染色陽性率。細胞染成淡黃色至棕黃色即判斷為陽性，染色強度評分標準：陰性為0分；1+為1分；2+為2分；3+為3分。染色陽性率評分標準：陰性為0分，1% ～25%為1分；26% ～50%為 2分；51%～75%為3分；76%～100%為4分。最后以“染色強度評分”和“染色陽性率評分”的乘積為總評分進行分組，胞質表達總評分≤6為低表達組，總評分＞6為高表達組；胞核表達總評分≤0為低表達組，總評分＞0為高表達組。

1.2.2 細胞培養 胃癌細胞 MGC-803和 SGC-7901在含10%胎牛血清的DMEM培養基中，置于含5%CO2的37℃培養箱中恒溫培養，取對數生長期細胞用于后續實驗。

1.2.3 細胞轉染 取狀態良好的對數生長期細胞接種于6孔板，將細胞分為空白組、無關序列組和siRNA URI干擾組，待細胞融合率達70%左右時，無關序列組和siRNA URI干擾組經Opti-MEM與Hiperfect轉染試劑混合物分別轉染無關序列片段和URI siRNA-A干擾片段，空白組加入等體積Opti-MEM培養基，混勻后置于5%CO2、37℃培養箱中培養。24 h或48 h后提取RNA或蛋白進行后續實驗。

1.2.4 qRT-PCR檢測轉染后細胞URImRNA表達量 細胞轉染24 h后收取各組細胞，按照RNA提取步驟提取RNA，紫外分光法測定RNA濃度，根據RNA濃度計算出逆轉錄所需RNA體積，DNA酶處理后以25℃5 min，42℃30 min，85℃5min反應條件逆轉錄合成cDNA。將含有2μL cDNA的20μL逆轉錄體系進行擴增，反應條件為95℃熱啟動3 min，95℃變性10 s，56℃退火延伸30 s，其中變性和退火延伸共40個循環。擴增產物的特異性由溶解曲線判定，相對定量分析采用2-△△CT法分析。每次實驗取3個復孔平均值，取3次獨立實驗的結果應用GraphPad Prism 7.0進行分析，并繪制柱狀圖。

1.2.5 蛋白質印跡法檢測URI蛋白表達 細胞轉染48 h后收集細胞，加入提前配制的細胞裂解液裂解細胞，提取總蛋白，測定濃度；加入5×上樣緩沖液和β-巰基乙醇混合物煮沸變性，置于-20℃保存。配制10%聚丙烯酰胺凝膠；提取的蛋白以70 V電泳至標準參照物分開后，再以100 V電泳至結束；4℃條件下350 mA恒流電轉膜90 min；5%脫脂牛奶封閉1 h；加入兔抗人URI抗體（1∶1 000）和兔抗人GAPDH抗體（1∶3 000），4℃孵育過夜；TBST洗膜15 min，重復3次；加入兔二抗（1∶5 000），37℃孵育1 h；TBST洗膜3次，每次15 min；ECL顯影凝膠成像系統檢測結果，每組實驗至少重復3次。

1.2.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡 取對數生長期兩類胃癌細胞接種于6孔板，分別設定空白組、siRNA URI干擾組以及順鉑處理的未轉染組、無關序列組、siRNA URI干擾組，待細胞融合率達50%～70%時進行細胞轉染，48 h后加入含順鉑的培養基誘導細胞凋亡。通過預實驗我們選擇在細胞多數存活的情況下能導致細胞DNA最大限度損傷的順鉑濃度誘導細胞凋亡，MGC-803細胞為 10μmol／L、SGC-7901細胞為5μmol／L，作用12 h。

胰酶消化細胞收集于EP管，PBS洗滌細胞，取約1×106個細胞，重懸于1 mL 1×結合緩沖液中，混勻后取100μL細胞至流式管中，依次加入5μL FITC AnnexinV和PI，室溫避光孵育15 min，檢測前每管中加入400μL 1×結合緩沖液，以陽性單染細胞作為對照，1 h內檢測，每組實驗重復3次。

1.3 統計分析

應用SPSS 22.0進行統計分析。通過配對非參數Wilcoxon檢驗法分析URI在癌及癌旁組織間的表達差異；URI的表達與臨床特征間關系的分析采用Fisher確切概率法；生存率比較采用log-rank檢驗；多組數據分析采用Levene進行方差齊性檢驗，若方差齊，則用單向方差分析，若有統計學意義，則進行兩兩之間比較，兩兩之間比較采用Bonferroni進行校正，否則用非參數分析，數據用均值±標準差（±s）表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 URI在胃癌組織的表達及其與臨床特征的關系

由于實驗過程中脫片、取材等因素的影響，芯片中6例組織點無法判讀，最終結果由84例病例共168個點判讀統計所得。90例中6例癌和癌旁共12個點被排除，包括 A1，E3，F5，A9，H15，J13點及其對應的癌旁點（圖1）。

圖1 胃癌組織芯片判讀范圍

統計結果表明，URI在胃癌組織細胞胞質中的表達明顯高于癌旁組織（P＜0.05），胃癌組織細胞胞核URI染色總評分均值比癌旁組織高，但差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1和圖2。

表1 URI在胃癌及癌旁組織表達的差異性n＝84

進一步分析顯示，URI在胃癌組織細胞胞質中的表達與患者性別相關（P＜0.05），而與年齡、腫瘤大小、病理分級、有無轉移及TNM分期等無關（P＞0.05），見表2。采用log-rank檢驗對胃癌患者URI高、低表達組間的生存率進行比較，結果顯示，胃癌組織胞質（χ2＝1.888，P＞0.05）及胞核（χ2＝3.587，P＞0.05）URI高、低表達組間患者生存率差異均無統計學意義。

圖2 胃癌及癌旁組織URI的IHC染色（×400）

表2 胃癌組織URI表達與臨床特征的關系

2.2 URI基因敲低細胞株的驗證

qRT-PCR結果顯示，URI siRNA-A片段轉染24 h后，兩種細胞株URImRNA的表達較無關序列轉染組顯著降低（P＜0.01，圖3A）；蛋白質印跡檢測結果顯示，URIsiRNA-A片段轉染48 h，細胞URI蛋白的表達顯著低于無關序列組（P＜0.01，圖3B）。以上結果表明URI基因敲低表達的兩類胃癌細胞株構建成功。

2.3 敲低URI促進順鉑誘導的細胞凋亡

流式細胞術檢測結果顯示，在MGC-803（圖4）和SGC-7901（圖5）兩株細胞中，未經順鉑處理時，URI siRNA組細胞凋亡率與空白組相比無顯著性差異；經順鉑誘導后，URIsiRNA組相較于無關序列組凋亡比例（早期凋亡+晚期凋亡）明顯增加（P＜0.01）。

圖3 兩類胃癌細胞URIm RNA和蛋白的表達

圖4 URI對MGC-803胃癌細胞凋亡的影響

圖5 URI對SGC-7901胃癌細胞凋亡的影響

3 討論

哺乳動物的URI高度保守，廣泛存在于細胞胞質、胞核和線粒體中［5，13］，并參與組成多種蛋白復合物［4，14］。目前認為URI參與了營養敏感的mTOR通路的調節，但對其與疾病的關系所知甚少。最早基于卵巢癌和肝癌的研究提示URI是一個癌基因［8-9］。我們參與了肝癌的研究［9］，此后我們對宮頸癌和胃癌細胞的研究也支持URI具有癌蛋白性質［12，15-16］。原癌基因的擴增或表達活性的增強是癌基因活化的一種機制，本研究中我們發現URI在胃癌組織細胞胞質中的表達明顯增加，提示URI同胃癌的發生發展有關。真核細胞中普遍存在PI3K／AKT／mTOR通路，該通路的活化狀態影響細胞多種重要生理過程，AKT磷酸化后作用于多種下游底物，包括 mTOR、survivin、Bcl-2、BAD等，影響細胞生長代謝、增殖、凋亡及細胞周期等［17］。URI是mTOR信號通路的磷酸化的靶，參與了對雷帕霉素敏感的信號通路轉錄的調節。研究發現URI在卵巢癌高表達，并通過抑制PP1γ的活性，持續活化mTOR下游通路，并通過負反饋系統增強S6K1的生存信號，促進卵巢癌細胞的生存，抑制凋亡［8］。mTOR感受營養狀態、調節細胞生長的作用主要在胞質中進行，因此我們推測URI主要在胞質中與mTOR通路相互作用，而不是作為轉錄因子在胞核中發揮作用。

URI的高表達同患者生存期及年齡、腫瘤大小、病理分級、轉移、TNM分期等沒有顯著相關性，提示URI可能主要涉及胃癌的發生機制而不影響胃癌預后。而胃癌組織胞質URI的表達在男女性之間差異有統計學意義，其意義有待進一步研究。Tummala等［10］的動物實驗已證實URI參與了肝癌發生機制。持續表達外源性URI的小鼠在8周時出現不同程度肝纖維化，24～54周時出現肉眼可見的腺瘤和早期肝癌，但在第8周停止小鼠URI表達后小鼠肝纖維化減輕，同時肝癌的形成受到抑制，表明URI的持續表達可促進癌前病變和早期肝癌的發生。

原癌基因激活后可通過抑制細胞凋亡、促進細胞存活使細胞發生惡性轉化。其中Bcl-2是重要的抑凋亡基因，而Bax的激活促進細胞凋亡。在凋亡信號刺激下，凋亡通路的Caspase-3激活，切割聚腺苷二磷酸 核糖聚合酶（poly-ADP-ribose polymerase，PARP），誘發凋亡。本實驗室前期研究中發現在多柔比星作用下，URI能增強Bcl-2的表達并降低Bax的水平，并能增加 Cleaved Caspase-3和 Cleaved PARP-1的水平［12］。順鉑是胃癌化療常用藥物，其導致的DNA雙鏈和單鏈斷裂將誘導細胞凋亡。通常各種因素導致的DNA損傷將激活細胞周期檢查點，使細胞阻滯在G1期，以便修復DNA損傷，如損傷不能修復，細胞將發生凋亡［18］。如果受損細胞不能經凋亡清除，DNA損傷的積累有可能使細胞發生惡性轉化形成腫瘤。我們通過在兩株胃癌細胞中敲低URI的表達，發現URI也能夠抑制順鉑誘導的胃癌細胞凋亡，進一步顯示URI可能通過抑制或減少細胞凋亡參與了胃癌的發病。

我們將在后續研究中通過建立胃癌動物模型，進一步深入探索URI在胃癌發病中的作用機制。