淡紫紫孢菌對黃瓜根結線蟲的防治效果

楊凡 蔡毓新 賈文華 甄熙 唐艷領 史宣杰

摘 要： 根結線蟲（Meloidogyne spp.）是一類嚴重危害經濟農作物并廣泛分布于世界各地的重要的植物病原線蟲。淡紫紫孢菌（Purpureocillium lilacinum）能夠寄生于根結線蟲和孢囊線蟲卵，對根結線蟲有很強的抑制作用。為了檢驗淡紫紫孢菌對黃瓜根結線蟲的防治作用，測定了淡紫紫孢菌pt361對黃瓜根結線蟲卵的寄生率、幼蟲致死率，并分析了淡紫紫孢菌的代謝產物白灰制菌素，同時測定了其在土壤中的存活狀態。結果表明，淡紫紫孢菌pt361菌株對線蟲卵寄生率為72.6%。其菌株混合發酵液對黃瓜根結線蟲幼蟲致死率達95.2%。對pt361菌株代謝產物進行檢測，發現有白灰制菌素A和B，其濃度分別為98.9%和71.2%，這可能與淡紫紫孢菌防治根結線蟲的機制有關。綜上所述，淡紫紫孢菌能有效防治黃瓜根結線蟲。

關鍵詞： 黃瓜； 淡紫紫孢菌； 根結線蟲； 白灰制菌素

Abstract： Root knot nematode is a kind of important plant disease nematode， which distributes widely and causes serious harm to crop production in the world. The Purpureocillium lilacinum can inhibit root knot nematode according to parasitic on the root knot nematodes and sporangium. In order to investigate the preventive effect of Purpureocillium lilacinum on cucumber root knot nematode， the parasitic rate and larvae of mortality when the Purpureocillium lilacinum pt361 interacted with the cucumber root knot nematodes were measured， the metabolites of leucinostatins was analyzed， and the survival state of pt361 strains in soil was determined. The results showed that the parasitism rate of pt361 strains on cucumber root knot nematodes was 72.6%， and the larva fatality rate of its mixed fermentation broth could reach 95.2% on the cucumber rootworm. It was found that the concentrations of leucinostatins A and B were respectively 98.9% and 71.2% when the metabolites of pt361 strains were detected， which might be related to the prevention mechanism to control the root knot nematodes. In conclusion， the Purpureocillium lilacinum could effectively control the root nematode of cucumber.

Key words： Cucumber； Purpureocillium lilacinum； Root knot nematode； Leucinostatins

根結線蟲（Meloidogyne spp.）是一種較為嚴重的土傳病害，全世界由根結線蟲造成的農作物損失高達10億美元[1-2]。黃瓜是最易受到根結線蟲侵染的作物之一，嚴重時可減產30%～40%，甚至絕收[3]。生產上防治根結線蟲主要有使用化學殺線劑、利用抗病品種以及生物防治等方式。化學防治雖然見效快，但有高毒性，污染環境。培育抗根結線蟲作物被認為是經濟、安全、高效的方法，目前在番茄上的抗根結線蟲基因Mi 1.2已被商業化生產[4]，但在黃瓜上的抗根結線蟲基因尚未被發現[5-6]。生物防治根結線蟲日益受到重視，是未來的趨勢之一。目前生物防治黃瓜根結線蟲的方法主要集中在線蟲天敵和殺線蟲植物提取液的研究上[7]，常見的有食線蟲真菌包括寡孢節叢孢（Arthrobotrys oligospora）、淡紫紫孢菌（Paecilomyces lilacinus）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）等寄生細菌以及放線菌中的一些種類。選擇合適的生防菌株防治黃瓜根結線蟲對農業的可持續發展有重要意義[8]。

淡紫紫孢菌（Purpureocillium lilacinum）能夠有效防治根結線蟲、穿孔線蟲、胞囊線蟲、腎形線蟲等，是一種極具推廣潛力的防治根結線蟲的習居菌和功能菌[9-10]。淡紫紫孢菌能破壞根結線蟲的蟲卵結構，同化蟲卵物質，使線蟲不能正常孵化。筆者在對淡紫紫孢菌致病力研究時，篩選出了一株對根結線蟲有致病力菌株pt361。筆者測定了淡紫紫孢菌pt361對黃瓜根結線蟲卵的寄生率以及對線蟲的致死力，并在菌株pt361的發酵液中檢測出了白灰制菌素A和B，其是白灰制菌素家族的重要組成成分，白灰制菌素A對線蟲有致死作用。同時對淡紫紫孢菌在土壤中的存活作了初步分析，以便為淡紫紫孢菌生防菌株的應用提供科學依據和技術指導。

1 材料和方法

1.1 菌株及培養方法

淡紫紫孢菌pt361，原始菌株pl36-1 T-DNA插入突變獲得穩定的突變子。28 ℃ PDA平板培養，4 ℃試管保存。

1.2 培養基配方

PDA培養基：土豆提取液200 g，葡萄糖18 g，瓊脂粉20 g，加水定容至1 000 mL，高溫滅菌30 min。

PDB培養基：土豆200 g，蔗糖20 g，水1 000 mL。

WA培養基：水1 000 mL，瓊脂18 g。

培養基B：50.0 g葡萄糖，5.0 g蛋白胨，5 g酵母提取物，1.0 g K2HPO4，10.0 g Na2CO3，0.2 g MgSO4·7H2O，加水定容至1 000 mL滅菌。

土壤分離培養基OHIO-agar：5 g葡萄糖，2 g酵母提取物，1 g NaNO3，0.5 g MgSO4·7 H2O，1 g KH2PO4，1 g牛膽粉，1 g丙酸鈉，18 g瓊脂，1 000 mL水。培養基中加入多菌靈，使培養基中藥劑最終質量濃度為30.0 μg·mL-1。

1.3 淡紫紫孢菌pt361對根結線蟲卵的寄生率測定

2017年3月在河南省農業科學院植物病理實驗室用1%次氯酸鈉溶液將黃瓜植株有根結線蟲病害的病根浸泡并震蕩4 min，清洗并過篩后收集根結線蟲蟲卵。處理組將淡紫紫孢菌pt361培養3 d后，將線蟲卵至于菌絲上方，每皿100個線蟲卵，3個皿1重復，共3次重復。28 ℃溫箱黑暗培養9 d。對照線蟲蟲卵不作任何處理。之后用乳酸甘油溶液處理2 min，會發現透明的卵是被淡紫紫孢菌寄生的，未被寄生的卵仍為深色。寄生率/%=被寄生的卵的數量/總調查卵的數量。

1.4 淡紫紫孢菌pt361對根結線蟲幼蟲致死率測定

配置淡紫紫孢菌無菌發酵液0.5 mL；將從黃瓜根結上面分離到的線蟲制成0.5 mL的線蟲液（100條·mL-1），然后將二者混合均勻并置于28 ℃培養箱中培養，對照組的線蟲液加入等量的清水處理。每個處理3次重復。24 h后計算幼蟲死亡率。死亡率=（Ca-Ta）/Ca，Ca代表對照中未死亡的線蟲數量，Ta代表處理中未死亡的線蟲數量。

1.5 淡紫紫孢菌pt361菌株代謝產物白灰制菌素的提取及測定

白灰制菌素提取方法如下[11]：將培養9 d的pt361菌株制成106孢子·mL-1孢子懸浮液，取1 mL放入100 mL培養基B的錐形瓶中28 ℃、200 r·min-1培養15 d。將1 mol·L-1 HCl溶液也加入到錐形瓶中，調節pH值到3.0，然后加入同體積的乙酸乙酯進行萃取，萃取液用5% NaHCO3溶液，將萃取液洗滌2次，真空旋轉干燥。然后用10 mL的甲醇溶液對粗提物即白灰制菌素進行溶解，再用質譜儀（Matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry MALDI-TOF MS）進行物質分析和濃度測定。

1.6 淡紫紫孢菌pt361菌株在土壤中的存活測定

將淡紫紫孢菌pt361菌株制成孢子液和固體發酵物2種形式，然后拌入土壤，使淡紫紫孢菌的濃度為106個·g-1。再將其裝入塑料杯（直徑7 cm，深8 cm）中，每杯裝土壤（黃壤土）基質（V土︰V沙=1︰1）200 g，然后將其埋于田間土壤中（河南省新鄉市原陽縣河南現代農業研究開發基地）。每間隔10 d取出塑料杯，測定淡紫紫孢菌pt361在土壤中的定殖量，持續測定60 d。測定時間自2017年5—7月。設未接種做對照。

1.7 檢測方法

將塑料杯中的土壤混勻后分別稱取10 g 2份，一份放入烘箱中80 ℃12 h測質量；一份用于分離淡紫紫孢菌。每次取3杯即為3次重復。將菌液均勻涂于平板上，放入恒溫箱中，28 ℃培養5 d后，計數平板菌落。

1.8 數據統計與分析

數據分析使用SPSS 12.0.1，數據表示平均值±SD標準差（mean±SD）。用Duncan's Multiple測試進行多組分比較，確定組間差異顯著。P<0.05被認為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 淡紫紫孢菌pt361對根結線蟲卵寄生率的測定

淡紫紫孢菌pt361對根結線蟲卵的寄生率測定結果表明pt361菌株對線蟲卵寄生率為72.6%。具體結果見圖1和表1。

2.2 淡紫紫孢菌pt361對根結線蟲幼蟲致死率的測定

淡紫紫孢菌株對根結線蟲幼蟲致死率測定表明，菌株混合發酵液對黃瓜根結線蟲幼蟲致死率達95.2%；pt361菌株對線蟲幼蟲致死率為3.6%。說明淡紫紫孢菌代謝產物對根結線蟲幼蟲有強致死作用（表2）。

2.3 淡紫紫孢菌pt361中白灰制菌素的測定

通過提取淡紫紫孢菌pt361白灰制菌素發現，原始菌株pt361中白灰制菌素A和B以一定的比例存在，可以用來作為檢測線蟲活性的重要指標。本試驗測得白灰制菌素A和B的質量分數分別為98.9%和71.2%（表3）。

2.4 淡紫紫孢菌pt361菌株在土壤中的存活動態

分別以固體發酵物和孢子液2種形式將pt361菌株施入土壤中，從圖3可以看出，隨著時間的延長菌株的定殖量有所降低。固體發酵物總體比孢子液的存活量高，60 d后2種形式的菌株存活量還保持在105、104數量級，因此，固體發酵物更有利于pt361菌株在土壤中的長期存活。

3 討論與結論

綜合開發能防治根結線蟲的菌劑是未來的研究熱點之一，已報道的叢枝菌根真菌能夠對西瓜嫁接苗抗南方根結線蟲，提高西瓜的生長指標和生理特性[12]，其也能與黃瓜建立共生體，防御黃瓜根結線蟲[13]；芽孢桿菌發酵的上清液處理黃瓜根結線蟲時，也能收到較好的效果[14]。淡紫紫孢菌是一種分布廣泛的線蟲卵寄生真菌[15]，是植物寄生線蟲的重要天敵，在殺線蟲時具有安全、高效、持效時間長的特點，其對線蟲的最重要的作用機制是寄生卵，寄生后使線蟲卵殼發生了一系列的化學變化，最終影響線蟲的正常發育而導致死亡[16]。

pt361菌株對黃瓜根結線蟲寄生率的研究結果表明，pt361菌株可以侵染根結線蟲的卵，寄生率達到72.6%；pt361菌株混合發酵液對線蟲的致死率達到95.2%，在試驗條件下，能有效防治根結線蟲。為了最大限度發揮淡紫紫孢菌的抗線蟲優勢，本試驗制定了2種形式的菌劑-固體發酵物和孢子液，發現固體發酵物能顯著提高pt361菌株在土壤中的存活率，可能是這種形式能給菌株提供固著的介質，使淡紫紫孢菌能穩定定殖在土壤中發揮生防效力。試驗結果也表明，淡紫紫孢菌pt361以固體發酵物可以在土壤中存活60 d以上，且能一直維持較高的定殖量，這有利于淡紫紫孢菌在整個作物的生育期持續的防治土傳病害。

進一步對根結線蟲的發酵液進行分析，發現了白灰制菌素A和B，白灰制菌素A在致死幼蟲方面有重要的作用，可以作為檢測線蟲的重要指標，可望在將來更深層了解淡紫紫孢菌對線蟲的致病機理及利用這一特點開發新的復合制劑用于防控根結線蟲，有利于淡紫紫孢菌在生產上推廣應用[17]。

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