關(guān)于血細胞計數(shù)板的解讀

宋正海

(江蘇省盱眙中學 淮安 211700)

血細胞計數(shù)板又稱血球計數(shù)器，是高中生物學實驗中重要的細胞計數(shù)工具。本文對血細胞計數(shù)板的結(jié)構(gòu)、計數(shù)原理等問題進行詳細的解讀。

1 解讀血細胞計數(shù)板的相關(guān)信息

1.1 目視信息及分析 血細胞計數(shù)板是一塊特制的厚型載玻片，有4個凹槽[1]，中間部分被一“H”型凹槽分成上、下兩個相同的計數(shù)平臺，每個平臺中有長、寬各3mm的計數(shù)區(qū)域，平均分為9個大方格。計數(shù)室(指中央的一個大方格，下同)的長和寬各是1mm，計數(shù)板上標識的“0.1mm”是指計數(shù)室的高度(圖1)。所以，計數(shù)室體積為1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=10-4mL。

血細胞計數(shù)板有兩種規(guī)格，一種是25×16型(湯麥式，標識為XB-K-25)，另一種是16×25(希利格式)。湯麥式血細胞計數(shù)板的每個計數(shù)室有25個中方格，每個中方格又分為16個小方格；而希利格式血細胞計數(shù)板每個計數(shù)室中有16個中方格，每個中方格又分25個小方格。

所以，上述兩種規(guī)格的血細胞計數(shù)板的計數(shù)室都有400個小方格，即體積為0.1mm3的計數(shù)室被平分為400個小格。

圖1 血細胞計數(shù)板的結(jié)構(gòu)示意圖

1.2 顯微觀察信息及分析 在顯微鏡下，可以觀察到計數(shù)室及其周圍被許多線條規(guī)則地分隔成許多小室(圖2)。計數(shù)板上的線條分為單線和雙線兩種，雙線區(qū)分不同中方格，每一中方格四周的線都是雙線，計數(shù)室與周圍區(qū)域的區(qū)分線也是雙線；單線用于區(qū)分小方格[2]。計數(shù)室內(nèi)的單線和雙線向外延伸，因此計數(shù)室外的線也可分為單線和雙線兩種。計數(shù)室周圍的線并非只是起引導作用，與計數(shù)室四個頂點相鄰的四個大方格，其內(nèi)只有中方格而無小方格，這四個區(qū)域可用于體積較大的單細胞計數(shù)(如白細胞等)。

圖2 計數(shù)室示意圖

2 細胞計數(shù)原理

由于計數(shù)室內(nèi)有400個小方格，如果對所有小方格進行細胞計數(shù)，因視野所限，不易操作，容易造成較大誤差，所以一般采用定點取樣計數(shù)。不同規(guī)格的血細胞計數(shù)板取樣點不同，湯麥式血細胞計數(shù)板計數(shù)室中有25個中方格，則取計數(shù)室4個角和中央的共5個中方格進行觀察計數(shù)；而希利格式血細胞計數(shù)板的計數(shù)室中有16個中方格，則取計數(shù)室4個角的中方格進行觀察計數(shù)。對于壓在方格界限上的細胞應當計數(shù)相鄰兩邊及其夾角上的細胞數(shù)，再加上中方格內(nèi)的細胞數(shù)，作為該中方格的細胞總數(shù)。如果一個方格內(nèi)細胞數(shù)過多，難以數(shù)清，應當再對樣液進行適當稀釋，一般以每個小方格內(nèi)分布4～5個細胞為宜。如果統(tǒng)計的每個中方格內(nèi)的細胞數(shù)目相互之間相差20個以上，表示細胞分布不均，必須對樣液搖勻后重新計數(shù)。

3 計算細胞密度的方法

對5(或4)個中方格計數(shù)完畢后，可通過下列兩種方法計算樣液中細胞密度： ①細胞個數(shù)/mL=5(或4)個中方格中細胞總數(shù)÷5(或4)×25(或16)×稀釋倍數(shù)×104；②細胞個數(shù)/mL=(80個小格中細胞數(shù))÷80×400×稀釋倍數(shù)×104。其中“×104”表示將0.1mm3(計數(shù)室體積)轉(zhuǎn)換成1mL溶液中細胞密度。

4 細胞計數(shù)注意事項及思考

如果計數(shù)室中細胞充分分散(圖3a)，則逐個計數(shù)；如果出現(xiàn)細胞成簇分布，能夠清晰分辨細胞核和細胞質(zhì)的分別計數(shù)為單個細胞(圖3b)；如果不能清晰分辨細胞核，則計為1個細胞(圖3c)。如果在實驗中多處出現(xiàn)圖3c的現(xiàn)象，最可能的原因為樣液未充分搖勻或稀釋倍數(shù)不夠所致，需重新實驗；如果只是一處或幾處出現(xiàn)此現(xiàn)象，可按以上計數(shù)方法進行計數(shù)。

圖3 細胞分散情況

在細胞計數(shù)中，為較快而準確的計數(shù)，一般選擇“S”型計數(shù)路徑進行計數(shù)： 第一排，從左向右；第二排，從右向左；第三排，從左向右；第四排，從右向左(圖4)[3]。在2018年江蘇省生物學科學業(yè)水平測試卷中，第40題第(2)小題即考查了對一個視野中酵母細胞最佳計數(shù)路徑的選擇。雖然此問題在教材中并未直接涉及，但卻是學生實驗操作中不可回避的問題，該試題通過對學生科學思維的考查，充分體現(xiàn)了生物學學科核心素養(yǎng)的要求，也再次提醒教學中要用教材教，而非教教材。

圖4 細胞計數(shù)路徑示意圖