原發性血小板增多癥患者鈣網蛋白基因突變及其與臨床療效的相關性

丁 莉，王 季，唐君玲，馬 濤，湯計瑞，朱小鳳，王雪梅，李曉明

(西南醫科大學附屬醫院血液科，四川瀘州 646000)

原發性血小板增多癥(essential thrombocythemia，ET)是一類以骨髓巨核細胞系終末分化細胞及外周血血小板增多為主要表現的造血干細胞惡性克隆性疾病。臨床可無癥狀或有血管舒縮功能障礙相關表現，有發生動靜脈血栓、出血、進展為骨髓纖維化或急性白血病的風險。既往的研究表明50%～60%的ET患者具有JAK2V617F突變，近年的研究發現鈣網蛋白(calreticulin，CALR)基因第9號外顯子突變存在于70%～80%的JAK2V617F突變陰性ET患者中[1]。有研究表明CALR基因突變常與更高的血細胞負荷及血栓事件相關[2]，但目前關于CALR基因突變是否影響ET患者臨床療效的相關報導尚少見，故本研究旨在檢測ET患者CALR基因的突變情況，評價其與ET患者臨床療效的相關性。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2014年12月至2017年6月就診于本科室確診為ET的61例患者(均已行JAK2V617F突變檢測)，診斷標準及危險分層參照WHO2008診斷標準[3]。其中JAK2V617F突變陽性(+)26例(男14例，女12例；年齡18～79歲)，JAK2V617F突變陰性(-)35例(男16例，女19例；年齡21～83歲)。收集35例JAK2V617F(-)患者骨髓或外周血標本，檢測其 CALR基因第9號外顯子的突變情況。上述患者接受臨床常規方案治療，回顧性分析其臨床資料，評估疾病緩解情況。本研究通過本院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1CALR基因第9號外顯子突變檢測 (1)在患者知情同意情況下，抽取患者骨髓或外周血EDTA抗凝標本約3 mL，提取全基因組DNA (DNA提取試劑盒由天根生化科技有限公司生產)，使用無菌去離子水將其稀釋至終濃度 200 μg/mL。(2)PCR反應體系及循環參數。CALR基因9號外顯子目標片段PCR引物由上海Invotrogen生物技術有限公司合成(正向引物5′-CTG GCA CCA TCT TTG ACA ACT T-3′；反向引物5′-GGC CTC TCT ACA GCT CGT C-3′)。反應體系25 μL：其中Taq 酶混合液12.5 μL(Takara 公司產品)、上下游引物各1.0 μL、去離子水8.5 μL、DNA模板2.0 μL。PCR反應參數：預變性94 ℃ 2 min;94 ℃變性15 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，40個總循環；72 ℃延伸1 min。(3)PCR產物檢測：使用2%瓊脂糖凝膠電泳初步檢測PCR產物。擴增出PCR產物的樣本剩余部分送Invitrogen公司純化后，使用ABI3730DNA 測序儀 (美國應用生物技術公司) 進行雙向測序。檢測到突變的樣本進一步送作克隆測序。

1.2.2危險分層標準[3](1)低危組：年齡小于60歲，無心血管疾病高危因素(如吸煙、肥胖、高血壓、糖尿病、高血脂等)，無血栓或栓塞病史。(2)高危組：年齡大于或等于60歲，且(或)有血栓或栓塞病史。 (3)中危組：介于低危與高危組之間。

1.2.3治療方案 所有入組患者：當血小板計數大于或等于1 000×109/L時聯合血小板單采，同時輔以羥基脲口服輔助降細胞以減小栓塞風險(據初治時血小板具體計數、年齡來確定起始劑量15～20 mg·kg-1·d-1)。當血小板計數小于1 000×109/L時，低危組及中危組患者單用重組人干擾素α2b(IFN-α2b，北京凱因益生公司)60 μg/d皮下注射(注射前0.5 h口服奈普生預防流感樣不良反應)，血小板降至正常上限開始減量為每2天1次，緩解后逐步減量至1～2次/周維持；高危組患者在使用干擾素(方案同上)時繼續聯合羥基脲輔助降細胞至安全范圍(血小板降至600×109/L左右)后單用干擾素，血小板降至正常上限開始減量為每2天1次，緩解后逐步減量至1～2次/周維持。

1.3療效評價標準 完全緩解：臨床癥狀消失，血象 (白細胞、紅細胞、血紅蛋白、血小板)恢復正常。部分緩解：血細胞計數較治療前下降50%，臨床表現有所減輕。治療無效：達不到部分緩解者[4]。

2 結 果

2.1PCR產物電泳及測序結果 CALR基因野生型樣本PCR目標產物長度377 bp，突變型長度則不等于377 bp。突變型電泳后可見雙條帶或較厚重模糊的單條帶，提示混合型產物(圖1所示)。PCR產物剩余部分送雙向測序。35例JAK2V617F(-)患者中共檢出18例(51.4%)CALR基因突變。包含3種類型：1型(52 bp缺失)15例(42.8%)、2型(5 bp插入)2例(5.7%)、3 bp缺失1例(2.9%)。測序提示存在突變的樣本進一步送克隆測序，3 bp缺失型未克隆成功。

1、 2：野生型產物。3、5、6、7：野生型及52 bp缺失型混合產物；4、8:野生型及5 bp插入型混合產物；9：DNA分子標記物圖1 部分樣本PCR產物凝膠電泳結果

2.2ET患者臨床特征及血液學療效分析 JAK2V617F(+)、CALR(+)、JAK2V617F及CALR雙陰性患者分別設為A、B、C組，各組間性別比較差異無統計學意義(P>0.05)。B組ET患者，初診時年齡常較其余兩組年輕化，同時危險度分層相對較低(P<0.05)。經常規臨床治療后，較多的A、B組患者能獲得不同程度血液學緩解，兩者間差異無統計學意義(P>0.05)，同時兩組患者的總緩解率均較C組患者高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

3 討 論

ET屬于BCR-ABL陰性骨髓增殖性腫瘤(classic myeloproliferative neoplasm，MPN)范疇。導致MPN的惡性克隆復雜多樣，其中JAK2、CALR、MPL基因突變被認為是MPN發病的使動因素，對MPN具有診斷意義。CALR已被證實可對多種細胞功能(如蛋白質折疊、胞內鈣離子濃度調控、細胞增殖、分化、凋亡等過程)造成影響[5]。FALCHI等[6]、MELIKYAN等[7]的研究發現：ET患者CALR基因突變常與更高的血小板計數、更低的血栓事件及更好的總生存相關。

本研究發現CALR基因第9號外顯子突變在JAK2V617F陰性的ET患者中檢出率較高(18/35,51.4%) 。其中以1型(52 bp缺失)最多見，占總突變83.3%；其次為2型(5 bp插入)占總突變11.1%；與近期國內外相關研究結果相近[8-9]。同時檢出1例少見的3 bp(AAG)缺失。相較于JAK2V617F(+)及雙陰性的ET患者，CALR(+)的ET患者初診時年齡更小、危險度更低，其生存、預后判斷受高齡伴隨其他疾病所帶來的影響可能相對較小。

聯合羥基脲及干擾素的常規臨床治療方案能使較多的JAK2V617F(+)及CALR(+)患者獲得完全或部分血液學緩解，相較于雙陰性患者總緩解率更高，這得益于具有JAK2或CALR基因突變的患者相較于雙陰性患者對干擾素應答更佳。有研究表明單一的JAK2V617F突變[10-11]或CALR突變[12]的細胞對干擾素-α可保持持久的敏感性。干擾素α治療紅細胞增多癥(PV)和ET的多年臨床實踐已證實其可清除JAK2V617F突變造血干細胞，使患者獲得完全分子生物學緩解，但部分患者停藥后可在分子學水平復發[13]。大多數患者僅能通過常規臨床治療獲得部分血液學緩解，如何使更多患者獲得完全、持續的血液學緩解甚至分子生物學緩解成為臨床治療的困難之處。

通過本次研究分析得出：CALR基因9號外顯子突變是ET患者重要分子遺傳學標志之一，此突變影響患者對臨床治療的應答。檢測ET患者CALR基因突變有助于提高對該類患者的臨床診斷、預后判斷及為設定更加個性化的治療方案提供依據，為更多患者帶來福音。