血細胞分析和血紅蛋白電泳在黎族珠蛋白生成障礙性貧血篩查中的應用??

胡俊杰，陳鑫蘋#，王 潔，張繼業，趙立強，李曉娟，徐衛華，余永娟，文海峰，文 書，李凌云，符生苗△

(1.海南省人民醫院醫學檢驗中心/海南省細胞與分子遺傳轉化醫學重點實驗室，海口 570311；2.海南省婦幼保健院檢驗中心，海口 570208；3.海南省白沙縣人民醫院檢驗科 571300；4.海南省昌江縣人民醫院檢驗科572700；5.海南省瓊中縣人民醫院檢驗科 572900；6.海南省陵水縣計劃生育服務中心檢驗科 572400)

珠蛋白生成障礙性貧血(又稱地中海貧血，以下簡稱地貧)是由于珠蛋白基因缺陷，導致血紅蛋白結構異常而發生的一種慢性溶血性單基因隱性遺傳病，我國長江流域以南的廣東、廣西、四川、云南、貴州、湖南、江西、浙江、福建、海南等地均是地貧高發地區，其中兩廣及海南地區的地貧流行形勢較為嚴峻[1-2]。黎族是海南省特有的少數民族，有研究顯示海南黎族人群地貧基因攜帶率為56.94%[3]，漢族人群地貧基因攜帶率為14.95%[4]。隨著分子生物學技術的發展，地貧基因檢測有望取代血細胞分析和血紅蛋白電泳而成為診斷地貧的金標準，但基因檢測成本較高，同時對操作環境和技術人員要求較嚴格，而黎族地區地處多為偏遠的山區，經濟發展落后，醫療條件較差，地貧基因檢測難于推廣，所以血細胞分析和血紅蛋白電泳依然是黎族地區篩查地貧的主要方法。本研究選取海南黎族地區的黎族和漢族中學生為調查對象，探討大樣本下地貧篩查中血細胞分析和血紅蛋白電泳的臨床應用價值，為黎族地區的地貧篩查提供有效依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年6月至2017年5月白沙、昌江、陵水、瓊中、五指山等5個黎族市縣，共7 615例中學生作為研究對象，其中黎族4 823例，漢族2 792例。采集靜脈血3 mL，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，4 ℃運輸保存。

1.2 方法

1.2.1血細胞分析 采用五分類血細胞分析儀XE-2100(日本Sysmex公司)進行血細胞分析，篩查標準以紅細胞平均體積(MCV)<82 fL或紅細胞平均血紅蛋白量(MCH)<27 pg為疑似地貧基因攜帶者。

1.2.2血紅蛋白電泳 采用Cappilarys 2型全自動毛細管電泳分析儀(法國Sebia公司)及配套試劑和質控品，嚴格按照標準操作規程進行血紅蛋白電泳檢測。篩查以血紅蛋白A(HbA)：96.5%～97.5%，血紅蛋白A2(HbA2)：2.4～3.0%，血紅蛋白F(HbF)：0～1.0%排除α，β地貧基因攜帶者。

1.2.3地貧基因檢測 使用全血DNA提取試劑盒(北京天根生物技術公司)結合Smart-32核酸提取儀(廣州中山大學達安基因股份有限公司)提取基因組DNA，使用PCR-流式熒光雜交法-地貧(α/β)基因檢測試劑盒(廣州中山大學達安基因股份有限公司)結合Luminex MAGPIX掃描儀(美國R&D系統公司)，定性檢測α-地貧的3種缺失型(--SEA、-α3.7和-α4.2)、3種突變型(WS122、QS125和CS142)及β-地貧的17種突變型(CD41-42、IVS-2-654、CD17、-28、CD26、CD71-72、CD43、-29、Int、CD14-15、CD27-28、-32、-30、IVS-1-1、IVS-1-5、CD31和Cap)。

1.2.4統計學處理 采用SPSS19.0統計軟件進行統計分析，計數資料以例數或百分率表示，采用χ2檢驗對血細胞分析、血紅蛋白電泳、聯合檢測的檢出率及3種方法的靈敏度和特異度進行統計分析，以P<0.05為差異統計學意義。靈敏度=真陽性數/(真陽性數+假陰性數)×100%，特異度=真陰性數/(真陰性數+假陽性數)×100%。

2 結 果

2.1地貧基因檢測結果 4 823例黎族研究對象中檢測出地貧攜帶者3 041例，檢出率為63.05%，其中α-地貧2 678例，占55.53%；β-地貧85例，占1.76%；α合并β地貧278例，占5.76%；正常者1 782例，占36.95%。2 792例漢族研究對象中檢測出地貧攜帶者624例，檢出率為22.35%，其中α-地貧548例，占19.63%；β-地貧51例，占1.83%；α合并β地貧25例，占0.90%；正常者2 168例，占77.65%，見表1。

表1 地貧基因檢測結果

2.2單獨檢測和聯合檢測的檢出率 黎族研究對象中血細胞分析地貧檢出率為76.59%(2 329/3 041)，其中α-地貧檢出率為74.64%(1 999/2 678)，β-地貧檢出率為89.41%(76/85)；α合并β地貧檢出率為91.37%(254/278)。血紅蛋白電泳檢測地貧檢出率為79.05%(2 404/3 041)，其中α-地貧檢出率為76.47%(2 048/2 678)；β-地貧檢出率為96.47%(82/85)；α合并β地貧檢出率為98.56%(274/278)。聯合檢測地貧檢出率為99.41%(3 023/3 041)，其中α-地貧檢出率為99.40%(2 662/2 678)；β-地貧檢出率為98.82%(84/85)；α合并β地貧檢出率為99.64%(277/278)，見表2。漢族研究對象中血細胞分析地貧檢出率為70.19%(438/624)，其中α-地貧檢出率為69.71%(382/548)；β-地貧檢出率為68.63%(35/51)；α合并β地貧檢出率為84.00%(21/25)。血紅蛋白電泳檢測地貧檢出率為93.27%(582/624)，其中α-地貧檢出率為94.52%(518/548)；β-地貧檢出率為80.39%(41/51)；α合并β地貧檢出率為92.00%(23/25)。聯合檢測地貧檢出率為98.40%(614/624)，其中α-地貧檢出率為98.54%(540/548)；β-地貧檢出率為98.04%(50/51)；α合并β地貧檢出率為96.00%(24/25)，見表3。

表2 黎族單獨檢測和聯合檢測的檢出率

表3 漢族單獨檢測和聯合檢測的檢出率

2.3單獨檢測和聯合檢測的靈敏度及特異度 黎族研究對象中血細胞分析的靈敏度為76.59%，特異度為74.54%；血紅蛋白電泳的靈敏度為79.05%，特異度為63.31%；聯合檢測的靈敏度為99.41%，特異度為46.75%。漢族研究對象中血細胞分析的靈敏度為70.19%，特異度為71.82%；血紅蛋白電泳的靈敏度為93.27%，特異度為54.01%；聯合檢測的靈敏度為98.40%，特異度為34.32%。黎族和漢族中聯合檢測的靈敏度均高于單獨檢測(P<0.01)，同時血紅蛋白電泳的靈敏度均高于血細胞分析(P<0.01)。黎族和漢族對比分析顯示，黎族血細胞分析的靈敏度高于漢族(P=0.001)，漢族血紅蛋白電泳的靈敏度高于黎族(P<0.01)，聯合檢測中黎族、漢族間無明顯差異(P=0.08)。黎族和漢族中聯合檢測的特異度均低于單獨檢測，且3種方法中黎族和漢族均以血細胞分析的特異度最高，此外黎族單獨檢測和聯合檢測的特異度均高于漢族(P<0.01)。

3 討 論

目前臨床上地貧的治療主要基于長期輸血和鐵螯合治療，此方法會產生許多并發癥，且重型地貧患者往往會因無法治療而死亡[5-6]，從社會經濟和醫療資源角度分析，預防地貧患兒的出生比治療更加重要。本研究中4 823例黎族人地貧基因攜帶率高達63.05%，表明黎族地區地貧流行狀況十分嚴重，而地貧篩查是地貧診斷和制定預防措施的第一步，在黎族人群大樣本量流行病學調查中的實際應用值得探討。

輕型地貧和缺鐵性貧血在臨床上均表現為小細胞低色素性貧血，僅以MCV和MCH為判斷指標往往不足以完全區分這兩種疾病，容易造成地貧的誤診[7]。本研究中血細胞分析在黎族人群中篩查地貧的靈敏度為76.59%，特異度為74.54%，與鄭琳等[8]在福建地區的研究結果存在一定差異，其中地理因素和研究人群的不同可能是主要原因。王英等[9]報道將MCV、MCH結合紅細胞體積分布寬度(RDW)檢測可以對缺鐵性貧血和地貧進行初步鑒別，此外宋鳳吉[10]研究也顯示缺鐵性貧血組的紅細胞(RBC)和血紅蛋白(Hb)均低于地貧組，但RDW高于地貧組。因此，為提高血細胞分析在地貧篩查中的靈敏度和特異度，可增加RBC、Hb和RDW等指標。

成年人正常Hb成分主要分為3類：HbA、HbA2、HbF，當α-地貧發生時α珠蛋白合成數量降低使得HbA2表達也降低，β-地貧發生時β珠蛋白合成數量降低使得HbA2或HbF表達增高，通過檢測Hb成分變化可以判斷地貧發生與否，以及地貧類型[11-12]。大多數實驗室設置HbA2的正常范圍為2.5%～3.5%，HbA2<2.5%初步判斷為α-地貧，HbA2>3.5%初步判斷為β-地貧，但不同地區及不同人群的HbA2參考值范圍存在差異[13]。本研究將HbA2<2.4%初步判斷為α-地貧，HbA2>3.0%初步判斷為β-地貧，結果顯示黎族和漢族人群血紅蛋白電泳的靈敏度均高于各自的血細胞分析靈敏度，表明血紅蛋白電泳在地貧篩查中表現較為優越。民族之間比較顯示漢族血紅蛋白電泳的靈敏度高于黎族(P<0.01)，但基因檢測顯示黎族地貧攜帶率高于漢族，表明初步設定的HbA2判斷標準更適用于漢族人群。在β-地貧中黎族的血紅蛋白電泳靈敏度高于漢族，結合漢族β-地貧攜帶率高于黎族(1.83%vs.1.76%)，表明利用HbA2值判斷地貧類型需要區分民族，即黎族和漢族的Hb成分的參考標準有較大差異。此外，本研究中黎族和漢族血紅蛋白電泳的特異度均較低，與張衛云等[14]報道用HbA2鑒別β-地貧的特異度達89.13%有較大差異。因此，海南地區的黎族和漢族人群Hb的各參考指標需要進一步優化以減小對特異度的影響。

楊梅[15]報道用聯合檢測方法檢測地貧的靈敏度達81.67%，特異度達95.83%。本研究中聯合檢測雖然具有高的靈敏度(黎族為99.41%，漢族為98.40%)，但特異度(黎族為46.75%，漢族為34.32%)明顯低于前者的研究結果，分析原因可能與前者研究樣本量小，地貧攜帶率代表性不夠有關，或本研究中設置的HbA2正常范圍較小，導致地貧檢測結果分析特異度降低。此外，本研究采用的地貧基因檢測方法只能檢測常見的23種地貧基因型，但結合聯合檢測結果發現存在血細胞分析和血紅蛋白電泳結果與地貧基因檢測結果不相符的異常黎族樣本，可能超出此基因檢測方法的檢測范圍但不能排除存在其他罕見或突變地貧基因型，需要用基因測序技術予以鑒定，所以聯合檢測結合基因檢測技術在尋找新的基因突變方面具有較高的參考價值，為黎族地貧后期研究提供依據。