PCR與RFLP方法快速診斷細菌感染的應(yīng)用與臨床價值分析

邵華

[摘要] 目的 分析細菌感染診斷中應(yīng)用PCR與RFLP方法快速診斷的價值。 方法 將已知菌7株與2013年1月—2017年12月臨沂市第三人民醫(yī)院接診的臨床確診為生殖道炎癥病變35例患者的標本作為研究對象，均進行PCR與RFLP方法快速診斷，將快速診斷結(jié)果與臨床診斷進行比較。 結(jié)果 PCR診斷已知菌陽性率為85.71%（6/7），而PFLP診斷均為100.00%；已知菌的PCR擴增產(chǎn)物酶切片片段長度實驗結(jié)果與RFLP電子克隆結(jié)果基本一致，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=1.004 8、2.005 1、3.011 6、3.045 2，P>0.05）。結(jié)論 相比傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)法診斷細菌感染，PCR與RFLP方法快速診斷有著快速、靈敏、準確等優(yōu)勢，可以明顯縮短診斷時間，可直接鑒定臨床標本，值得借鑒。

[關(guān)鍵詞] 細菌感染；生殖道炎癥；PCR；RFLP；價值；分析

[中圖分類號] R5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2018）06（b）-0014-03

Analysis of Application of PCT and RFLP Method in Rapid Diagnosis of Bacterial Infection and Its Clinical Value

SHAO Hua

Department of Clinical Laboratory， People's Hospital of Linyi Economic and Technological Development Zone & Linyi Third Peoples Hospital， Linyi， Shandong Province， 276000 China

[Abstract] Objective To analyze the application of PCT and RFLP method in rapid diagnosis of bacterial infection and its clinical value. Methods 7 strains of know bacterial and 35 cases of patients with inflammatory lesions of the genital tract confirmed by our hospital from January 2013 to December 2017 were selected as the research objects for PCR and RFLP rapid diagnosis， and the rapid diagnosis results and clinical diagnosis results were compared. Results The positive rate of known bacterial diagnosed by PCR， and positive rate of PFLP diagnosis were respectively 85.71%（6/7） and 100.00%， and the fragment length of the PCR amplified products of the known bacteria was basically consistent with the results of RFLP electron cloning， the difference was not statistically significant（χ2=1.004 8， 2.005 1， 3.011 6， 3.045 2， P>0.05）. Conclusion The PCR and RFLP rapid diagnosis is rapid， sensitive and accurate compared with the traditional germiculture in diagnosis bacterial infection， which can obviously shorten the diagnosis time and directly identify the clinical specimens， and it is worth reference.

[Key words] Bacterial infection； Inflammation of the genital tract； PCR； RFLP； Value； Analysis

生殖道炎癥屬于比較常見的多發(fā)性疾病，這種疾病多因細菌感染所致，盡早診斷與治療是防治關(guān)鍵。微生物感染常用的診斷方式為分離培養(yǎng)及鑒定，盡管準確率高，但其比較耗時，方法也相當(dāng)繁瑣[1-3]。為了探討這種快速方法診斷細菌感染的價值，該文就2013年1月—2017年12月臨沂市第三人民醫(yī)院收治的35例經(jīng)臨床確診的生殖道炎癥疾病患者與已知菌7株實施了研究，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

將已知菌7株與臨沂市第三人民醫(yī)院接診的臨床確診為生殖道炎癥病變35例患者的標本作為研究對象，患者均為該院收治的陰道炎與宮頸炎患者，年齡20～67歲，均值（45.9±5.4）歲；陰道炎23例、宮頸炎12例。此外，入選對象和（或）家屬簽署知情同意書愿意配合研究，且該研究經(jīng)該院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準通過。

1.2 方法

1.2.1 菌株類型 共計7株菌株類型，為該市某醫(yī)院微生物室保存及提供，包括大腸埃希菌（ATCC 25922）、表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、屎腸球菌及衣氏放線菌。

1.2.2 標本提供 包括人白細胞DNA、白假絲酵母菌DNA及HBV-DNA陽性血清標本，均由上述醫(yī)院檢驗科提供。

1.2.3 主要的試劑及相關(guān)的儀器 該次研究中涉及的試劑與儀器如下：PCR反應(yīng)試劑盒、限制性內(nèi)切酶Hae Ⅲ、HBV DNA提取試劑盒、酶切緩沖液10×M Buffer（2 μL）、酶切位點、毛細管（45×50 μm）、去離子甲酰胺、POP-Polymen、GeneScan 500ROX、瓊脂糖、PCR熱循環(huán)儀、凝膠成像儀、Mupid電泳儀等。

1.2.4 細菌培養(yǎng) 所有患者均采取生殖道標本，以棉拭子從生殖道獲取標本，接種在瓊脂培養(yǎng)基與巧克力瓊脂培養(yǎng)基，以及伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基、淋病奈瑟菌培養(yǎng)基中，溫度為37℃，時間18～24 h。

1.2.5 熒光標記引物 熒光標記引物采取合成16SrRNA基因序列引物，其中序列情況如下：①上游引物：5（FAM）-ACACTGGAACTGAGACACGG-3；②下游引物：5–CTCTACGCATTTCACCGCTAC-3。

1.2.6 PCR模板制備 ①標本PCR模板：從宮頸或陰道用拭子取標本1.5 mL放于無菌離心管，加1 mL無菌水，反復(fù)振蕩混懸后將拭子棄去，以1 500 r/min離心5 min，取0.5 mL上清液，然后繼續(xù)以15 000 r/min離心10 min，棄去上清液后以無菌水進行洗滌沉淀，反復(fù)操作3次，每次離心速率為15 000 r/min、時間為10 min，最終取15 μL沉淀加0.2 mL微量離心管，99℃裂解10 min后浸入冰浴待用。②已知菌PCR模板：收集培養(yǎng)的細菌，用無菌水配制0.5麥氏單位菌懸液，取15 μL加微量離心管后，裂解后置入冰浴待用。

1.2.7 PCR擴增 取dNTP混合物4 μL、10×ExTaq Buffer 5 μL、引物1與引物2各2 μL，以及15 μL模板、0.25 μL的1.25 U TaKaRa Ex Taq及無菌水，控制總體積50 μL，PCR擴增時將反應(yīng)體系管置入離心機中，以3 000 r/min離心速率處理30 s，置入PCR熱循環(huán)儀中擴增，反應(yīng)的條件包括預(yù)變性94℃ 1 min、變性98℃ 15 s、退火55℃ 1 min、延伸72℃ 1 min，共計30周循環(huán)，之后置入4℃保存待檢。

1.2.8 酶切 取擴增產(chǎn)物2 μL，加入2 μL buffer、1 μL Hae Ⅲ及15 μL無菌水，37℃孵育1 h，置入-20℃冷凍保存。

1.2.9 RFLP分析 將酶切產(chǎn)物1 μL和24 μL去離子甲酰胺與1 μL ROX混勻后，95℃變性2 min，快速冰浴冷卻，實施RFLP分析，其中電壓15 kV、電流12 μA、溫度60℃、功率9.9 mW、時間25 min。

1.3 統(tǒng)計方法

該次研究數(shù)據(jù)采取SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理，計數(shù)資料用[n（%）]表示，采取χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 已知菌PCR及RFLP診斷結(jié)果情況

PCR診斷已知菌，其中陽性有大腸埃希菌、表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、屎腸球菌6種，而衣氏放線菌為陰性，陽性率為85.71%（6/7），而PFLP診斷為100.00%。

2.2 已知菌PCR擴增產(chǎn)物的PCR與RFLP結(jié)果

已知菌的PCR擴增產(chǎn)物酶切片片段長度實驗結(jié)果與RFLP電子克隆結(jié)果基本一致，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表1。

3 討論

生殖道感染屬于常見疾病，多為細菌感染所致，在女性中除了會造成盆腔炎與不孕不育等，還可能導(dǎo)致性傳播疾病、新生兒先天性疾病等[4-6]，為此盡早明確診斷與處理十分必要。傳統(tǒng)診斷方式為分離培養(yǎng)法，被公認為金標準，但耗時長，生長緩慢、無法人工培養(yǎng)及條件苛刻等情況下的標本不宜采用[7-11]，為此需尋求一種準確、快速的診斷方式。

在該次研究中顯示PCR診斷已知菌陽性率為85.71%（6/7），生殖道炎癥標本陽性率為82.86%（29/35），而PFLP診斷均為100.00%；已知菌的PCR擴增產(chǎn)物酶切片片段長度實驗結(jié)果與RFLP電子克隆結(jié)果基本一致，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。該研究結(jié)果與同類研究相似，李琳等學(xué)者[12]采取16S rRNA集技術(shù)對已知菌8株、生殖道炎癥標本及其培養(yǎng)物38例進行PCR擴增與限制性內(nèi)切酶處理，并予以RFLP鑒定不同病原菌，結(jié)果顯示已知菌擴增陽性率為75%，生殖道感染標本PCR擴增陽性率則為79%，RFLP陽性率均為100%；已知菌株P(guān)CR擴增產(chǎn)物5端HaeⅢ完全酶切片段的RFLP結(jié)果和電子克隆產(chǎn)物酶切片段基本相同，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。PCR與RFLP快速診斷方法能將細菌鑒定到種，測定時間不超過24 h，單份標本能單獨測定[13-16]，而且實際操作中不做酶切者當(dāng)日便可檢出結(jié)果，需酶切者次日也可獲取檢測結(jié)果，這種方法對象為細菌核酸，和傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)相比，靈敏度更高，耗時更短，使得假陰性結(jié)果更少，在各類細菌感染中均可快速明確診斷[17-20]。

綜上所述，相比傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)法診斷細菌感染，PCR與RFLP方法快速診斷有著快速、靈敏、準確等優(yōu)勢，可以明顯縮短診斷時間，可直接鑒定臨床標本，值得借鑒。

[參考文獻]

[1] Bentz，S，Rigaud，T，Barroca，M，et al.Sensitive measure of preva lence and parasitaemia of haemosporidia from European blackbird （Turdus merula） populations： value of PCR與RFLP and quantitative PCR[J].Parasitology，2006，133（pt 6）：685-692.

[2] 豆清婭，吳安華.脈沖場凝膠電泳技術(shù)及其在細菌感染性疾病中的應(yīng)用[J].中國感染控制雜志，2017，16（7）：683-686.

[3] 姚濤.降鈣素原和外周血白細胞/血小板單獨或聯(lián)合檢測對肝硬化合并細菌感染患者早期診斷中的應(yīng)用價值研究[J].中國醫(yī)師雜志，2016，18（10）：1536-1538.

[4] 孔欽翔，胡立芬，周仲松，等.聚合酶鏈反應(yīng)法快速診斷肝硬化患者腹水細菌感染臨床應(yīng)用研究[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2016，26（19）：4358-4361.

[5] Chiara Azzari，姚開虎.RT-PCR方法檢測兒童細菌感染[J].中國循證兒科雜志，2013，8（1）：5-7.

[6] 周愛萍，吳文娟.高分辨熔解曲線分析在臨床細菌鑒定及藥敏檢測中的應(yīng)用[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2017，40（2）：84-87.

[7] 張巧伶，蘇立德，呂志強等.細菌感染對家蠶DNA甲基化與組蛋白乙酰化相關(guān)基因表達的影響[J].昆蟲學(xué)報，2015，58（9）：941-949.

[8] 劉景峰，劉培，支德源，等.血清 PCT 在小兒活體肝移植術(shù)后早期細菌感染診斷中的價值[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2017，40（1）：46-49.

[9] 韓亮，周東輝，劉卿，等.基于ITS序列鑒別3種感染白牦牛線蟲的PCR與RFLP方法的建立[J].中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，2017，35（2）：164-168.

[10] 陳姣，張苗，蔣春明，等.血清降鈣素原在診斷慢性腎臟病合并細菌感染中的臨床價值[J].東南大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2016， 35（4）：550-554.

[11] 韓丹，鐘新生.中性粒細胞/淋巴細胞計數(shù)比值在老年人肺部細菌感染診斷中的應(yīng)用價值[J].中國老年學(xué)雜志，2016，36（7）：1655-1657.

[12] 李琳，張卓然，李坤，等.建立PCR-CE-RFLP方法快速診斷女性生殖道的細菌感染[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志，2006，1（1）：49-52.

[13] 冷青文，閆遵祥，李志遠，等.巴什拜羊OLA-DRB3基因多態(tài)性與綿羊肺炎支原體感染相關(guān)性研究[J].中國畜牧雜志，2015，51（17）：6-9，22.

[14] Japoni A，Gudarzi M，F(xiàn)arshad S，et al.Assay for integrons and pattern of antibiotic resistance in clinical Escherichia coli strains by PCR與RFLP in Southern Iran[J].Japanese journal of infectious diseases，2008，61（1）：85-88.

[15] Abd-Eldaim MM，Wilkes RP，Thomas KV，et al.Development and validation of a TaqMan real-time reverse transcription-PCR for rapid detection of feline calicivirus[J].Archives of virology，2009，154（4）：555-560.

[16] 張淑青，袁寶軍，李超，等.NLR、CD64和 PCT 檢測在血液細菌感染中的價值[J].中國實驗診斷學(xué)，2015，15（8）：1314-1317.

[17] 慕月晶，王偉佳，嚴海忠，等.PCT檢測在全身和局部細菌感染診斷中的臨床應(yīng)用[J].檢驗醫(yī)學(xué)，2015，12（1）：17-20.

[18] 許娜，劉永霞，高莉莉，等.肝硬化細菌感染患者血清中Presepsin檢測的臨床意義[J].現(xiàn)代檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2017，32（6）：92-95.

[19] 吳翼君，余靜，管利榮，等.CRP以及PCT檢測應(yīng)用于胎膜早破新生兒細菌感染的診斷意義[J].標記免疫分析與臨床，2015，22（7）：640-642，645.

[20] 張慶勇，鮮勝，曾晶晶，等.細菌感染中WBC、N%、CRP及PCT檢測的比較分析[J].國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2015，14（3）：289-290.

（收稿日期：2018-03-15）