RhoA/ROCK1在多發性骨髓瘤中的表達及臨床意義

吳春葉 羅友紅 蔣端鳳 何玉嬋 高彤彤 黃勃 王曉桃

1桂林醫學院第二附屬醫院（廣西桂林 541100）；2桂林醫學院附屬醫院（廣西桂林 541100）

多發性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一種骨髓漿細胞異常增殖引起的廣泛浸潤、難以治愈的疾病［1］，其骨質進行性破壞，臨床主要表現為骨髓瘤骨病（myeloma bone disease，MBD），常伴有嚴重的骨質疏松、骨痛、病理性骨折等骨相關事件［2］。目前MBD的主要發生機制是在骨髓微環境中，瘤細胞與骨髓基質細胞通過經典途徑如細胞核因子NF?κB受體活化因子（receptor activator of nuclear factor?kappa B，RANK）/RANK 配基（RANK ligand，RANKL）/護骨素（osteprotegerin，OPG）、骨架蛋白Axin和非經典途徑如巨噬細胞炎癥蛋白?1α（mac?rophage inflammatory protein 1?α，MIP?1α）等信號通路導致破骨細胞活性增強和成骨細胞功能受抑制，造成溶骨性病變，阻礙新骨生成［3-4］。RhoA屬于Rho家族蛋白的重要成員，具有GTP酶活性，其下游Rho相關卷曲螺旋形成蛋白激酶（Rho?associ?ated coild?protein kinase，ROCK）是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，有兩種同源性極高的異構體ROCK1和ROCK2，ROCK1主要存在肝、脾、骨骼肌等非神經組織中，是一種調節肌球蛋白輕鏈活性的激酶，導致肌動蛋白-肌球蛋白收縮，這是細胞運動和骨質破壞的基礎［5-6］。有研究發現RhoA/ROCK1參與調控細胞形態、細胞骨架重構、細胞遷移等多種細胞功能［6-7］。而目前國內外關于RhoA/ROCK1在MM中的表達狀態及機制研究尚未見報道，本研究旨在明確MM患者中RhoA/ROCK1的表達及與臨床各指標的關系，試圖探討其在MBD中發生、發展的作用，為MM的發生機制及臨床治療提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017年4～12月在桂林醫學院附屬醫院及第二附屬醫院住院治療的46例MM患者骨髓標本作為實驗組，其中男22例，女24例，年齡47～75歲，中位年齡61歲；其中初診患者13例，復發難治患者33例；免疫分型：IgG 20例，IgA 16例，λ輕鏈型 24例，κ輕鏈型20例；Durie?Salmon，（D?S）分期：Ⅰ期4例，Ⅱ期 6例，Ⅲ期 36例）；國際分期體系（International staging system，ISS）分期：Ⅰ期14例，Ⅱ期17例，Ⅲ期15例。入組的MM患者因多種原因未行熒光原位雜交技術為基礎的Mayo危險分層檢查。實驗組的MM患者診斷符合國際骨髓工作組的標準（2014年修訂）。排除標準：（1）有嚴重心、肝、腎等重要臟器疾病病史；（2）有其他惡性腫瘤病史；（3）合并嚴重代謝性或感染性疾病；所有MM患者均進行全身或局部的X線檢查確定有無骨質疏松或溶骨性破壞，若X線檢查為陰性者，用電子計算機斷層掃描、磁共振成像及全身骨掃描等檢查，以X線為標準將MM進行分級［8］：1級10例（21.74%），2級6例（13.04%），3級30例（65.22%）。

選取同期住院初診的原發免疫性血小板減少癥（immune thrombocytopenia，ITP）20例患者骨髓標本為對照組，其中男9例，女11例；年齡48～68歲，中位年齡58歲。對照組的診斷符合中華血液學分會血栓與止血學制定ITP診斷與治療中國專家共識的標準（2016年版），并常規行骨密度測定排除有骨質疏松或骨質破壞的患者。本研究經醫院倫理委員批準，所有患者簽署知情同意書，兩組患者年齡、性別資料具有可比性。校正血鈣值（αCa）＝血清鈣值＋（40-血清白蛋白測定值）×0.025 mmol/L。

1.2 主要實驗儀器與試劑 人外周血淋巴細胞分離液（天津市灝洋生物制品科技有限責任公司）、RhoA ELISA試劑盒（ELabscience公司），ROCK1 ELISA試劑盒（上海酶研生物科技有限公司），總RNA提取試劑盒（DP419）、FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒（KR116）、SYBR GReen試劑盒（FP205）（北京天根生化科技有限公司），CFX96實時熒光定量PCR儀（Bio?Rad公司），Thermo Multiskan GO全波長酶標儀（Thermo公司），引物序列：RhoA上游：5′?GACTCGGATTCGTTGCCTGA?3′，下游：5′?TGGGAACTGGTCCTTGCTGA?3′，擴增片段 116 bp；ROCK?1上游：5′?CTGCAACTGGAACTCAACCAA?GAA?3′，下游：5′?GCTGGCCAACTGCATCTGAA?3，擴增片段138 bp；內參β?actin上游：5′?TGGCACCC?AGCACAATGAA ?3′，下 游 ：5′?CTAAGT?CATAGTCCGCCTAGAAGCA?3′，擴增片段 186 bp。引物由上海生物工程有限公司合成。

1.3 標本收集及處理 肝素抗凝管分別收集符合要求的骨髓標本3～5 mL，先加3 mL人外周血淋巴細胞分離液至15 mL離心管內，再將等量的骨髓液沿管壁緩慢移至分離液之液面上，500×g離心25 min，取其上清液用于ELISA，提取中間單個核細胞層總RNA用于實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT?PCR）。

1.4 研究方法 ELISA定量檢測RhoA、ROCK1的蛋白表達，實驗步驟嚴格按照ELISA操作說明書進行，每個標本做3個復孔，結果取均值。qRT?PCR檢測骨髓單個核細胞RhoA、ROCK1的mRNA表達：（1）Trizol試劑提取單個核細胞總RNA；（2）cDNA第一鏈合成試劑盒將RNA反轉錄為cDNA；（3）SYBR GReen試劑盒（FP205）進行PCR擴增。PCR反應條件：總反應體系20 μL，95 ℃ 15 min（預變性）、95℃ 5 s（變性）、60℃ 20 s（退火）、72℃30 s（延伸），共40個循環。以β?actin表達量作為內參，用2-△△Ct值表示mRNA的相對表達量。每個標本做3個復孔，結果取均值。

1.5 統計學方法 采用SPSS 20.0處理數據，計量資料以x±s表示，計數資料及等級資料以中位數M（min，max）表示，兩參數的均數比較采用t檢驗或方差分析。兩因素相關分析計量資料采用pearson相關分析，等級資料采用Spearman分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 骨髓RhoA、ROCK1表達水平 實驗組中RhoA和ROCK1蛋白與mRNA表達水平高于對照組，差異具有統計學意義（P＜0.01）。見表1。

表1 RhoA、ROCK1的mRNA相對表達量及蛋白表達水平Tab.1 Relative expression of mRNA and protein expression levels of RhoA and ROCK1x±s

2.2 RhoA、ROCK1表達水平與骨質破壞程度關系 將骨質破壞程度分為早期（1、2級）、晚期（3級），其中早期骨質破壞較輕，晚期骨質破壞較重。方差分析表明骨質破壞輕度組（1、2級）和嚴重組（3級）的RhoA蛋白與mRNA水平均高于對照組，且嚴重組的RhoA蛋白與mRNA水平均高于骨質破壞輕度組（均P＜0.05）。骨質破壞嚴重組的ROCK1蛋白與mRNA水平均高于對照組（P＜0.05）；事后經LSD檢驗發現骨質破壞嚴重組ROCK1的mRNA水平高于骨質破壞輕度組（P＜0.05），而蛋白的表達水平在兩組間差異無統計學意義（P＞0.05）；骨質破壞輕度組的ROCK1蛋白與mRNA水平與對照組相比有升高趨勢，但差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表2和圖1。

表2 不同程度骨質破壞組中RhoA、ROCK1 mRNA相對表達量及蛋白表達水平Tab.2 Relative expression of mRNA and protein expression levels of RhoA and ROCK1 in different degrees of bone destruction x±s

圖1 不同程度骨質破壞組中RhoA、ROCK1 mRNA相對表達量及蛋白表達水平Fig.1 Relative expression of mRNA and protein expression levels of RhoA and ROCK1 in different degrees of bone destruction

2.3 RhoA和ROCK1的蛋白表達水平與MBD患者臨床參數的相關性 用Pearson與Spearman相關分析表明RhoA的蛋白表達水平與αCa、β2?微球蛋白（β2?microglobulin，β2?mg）、骨質損害分級、ISS分期、D?S分期呈正相關，而與血紅蛋白（hemoglo?bin，Hb）呈負相關；ROCK1與αCa、β2?mg、骨質損害分級呈正相關，而與Hb呈負相關。見表3。

3 討論

目前研究發現RhoA/ROCK1在乳腺癌、肝癌、胃癌等惡性腫瘤中被激活后呈高表達狀態，并與腫瘤的生物學行為密切相關［9-10］。TAKESHITA等［11］在鼠的關節炎模型中發現RhoA/ROCK信號通路可改變關節軟骨的細胞骨架，從而導致關節軟骨細胞退變，而RhoA/ROCK信號通路的抑制劑可延緩關節炎的發生及緩解疼痛，這提示RhoA/ROCK1可能在MBD的發生、發展中有著重要的作用。

本研究通過提取MM患者骨髓上清液及單個核細胞中RhoA、ROCK1的蛋白與mRNA，發現其表達水平高于對照組，這可能說明在MM中骨髓瘤細胞促進RhoA、ROCK1的分泌而呈高表達狀態。其機制可能是在MM中，瘤細胞分泌的細胞因子如白介素?6、MIP?1a、sclerostin、RANK/RANKL等促進RhoA、ROCK1的分泌，有文獻報道在鼠源性骨髓瘤中瘤細胞分泌的MIP?1α可促使小分子G蛋白Ras和Rho異戊稀化，從而導致骨髓瘤患者骨髓中的RhoA水平增高［4，12-14］，增高的RhoA與骨髓微環境中GTP酶結合而激活下游ROCK基因，并介導ROCK的下游底物如肌球蛋白輕鏈磷酸酶、磷酸肌醇 3-激酶等磷酸化而促進腫瘤細胞增殖［13，15］，從而形成惡性循環，這也說明RhoA、ROCK1能反映瘤負荷水平。從臨床相關資料中發現RhoA與ISS分期、D?S分期、β2?mg呈正相關，ROCK1與β2?mg呈正相關。而ISS分期、D?S分期及β2?MG可很好地反映MM患者的瘤負荷水平。其機制可能是瘤細胞分泌的RhoA是通過羧基端與ROCK1緊密結合，ROCK1抑制細胞外信號調節激酶1/2（extracel?lular signal?regulated kinase，Erk1/2）釋放，而Erk1/2的作用底物是Bax，Erk1/2抑制后下調Bax，抑制Erk1/2/Bax/Caspase信號通路，導致瘤細胞凋亡受阻，瘤負荷增加［9，13，16］。

表3 RhoA、ROCK1的蛋白水平與MBD患者臨床參數的相關性分析Tab.3 Correlation analysis between protein levels of RhoA and ROCK1 and clinical parameters of patients with MBD

本研究發現實驗組的MM患者RhoA蛋白與mRNA水平均高于對照組，骨質破壞嚴重組中RhoA蛋白與mRNA水平高于骨質破壞輕組，骨質破壞嚴重組的MM患者ROCK1 mRNA水平高于骨質破壞輕組，骨質破壞輕組的MM患者ROCK1蛋白與mRNA水平均高于對照組，這些結果提示RhoA、ROCK1與骨質破壞嚴重程度相關，參與了MBD的發生及發展。臨床相關資料也表明RhoA、ROCK1與aCa、骨質損害分級呈正相關，而αCa、骨質損害分級主要反映骨質破壞情況，提示骨質破壞越嚴重，RhoA、ROCK1表達水平越高，這與乳腺癌骨轉移等報道一致［17］，當骨質破壞愈嚴重，破骨細胞因子如MIP?1a及RANK/RANKL增加，刺激瘤細胞增殖從而分泌更多的RhoA，RhoA參與細胞功能需通過與其下游效應蛋白ROCK1的相互作用來實現［3-4，6］。ROCK1 蛋白質序列中含有Erk結合結構域，在MBD患者中，活化的ROCK1通過蛋白序列中Erk結合結構域結合Erk1/2，ROCK1又通過羧基端與細胞膜上的RhoA結合，ROCK磷酸化后激活磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號通路，隨后不僅誘導瘤細胞增殖、遷移、黏附、瘤細胞耐藥，而且能誘導破骨細胞分化、成熟、增加破骨細胞的數量和功能，導致溶骨性破壞［16，18-19］。值得一提的是骨質破壞輕度組的MM患者ROCK1蛋白與mRNA水平較對照組相比有升高的趨勢，在骨質破壞嚴重組的MM患者ROCK1蛋白水平較破壞輕組也有相同的趨勢，但無明顯統計學差異。這可能與以下原因有關：（1）MM患者的骨質可能未達到骨質疏松或破壞不明顯；（2）下游ROCK1因子可能尚未完全活化；（3）研究樣本數量少。

本研究還發現RhoA、ROCK1與Hb呈負相關，由于Hb是反映患者體能狀態的常用指標之一，本身瘤細胞浸潤骨髓、血黏度升高、反復感染、促紅細胞生成素減少等可直接抑制造血干細胞造血，而增殖的瘤細胞大量分泌RhoA、ROCK及高瘤負荷水平可間接抑制造血功能，從而導致患者貧血［20］。

綜上所述：RhoA/ROCK1在MM患者中呈高表達狀態，骨質破壞越嚴重，其在骨髓中的表達水平越高，并與骨質破壞程度和aCa、β2?mg、ISS分期等相關，這提示RhoA/ROCK1可能在MM的發生發展中發揮重要作用，但其具體高表達機制有待下一步深入研究，以便為MBD的臨床治療提供新思路。