食品中沙門氏菌檢測方法比較

程 浩

(安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽合肥 230051)

沙門氏菌(Salmonella)是一種常見的食源性致病菌，主要寄生于人類和動物腸道傳染致病，可致腸熱癥、慢性腸炎、食物中毒等[1]。由于沙門氏菌經常存活于肉制品、蛋類、水產品中，故世界各國普遍規定食品中不得檢出沙門氏菌。據統計，我國細菌性食物中毒中70%～80%是由沙門氏菌引起，人一旦攝入含有大量沙門氏菌(106～107個/g)的動物性產品，就會引起細菌性感染，進而在毒素作用下發生食物中毒導致胃腸炎、傷寒和副傷寒，且沙門氏菌的傳播媒介眾多，肉、蛋以及食品從加工到出售的過程中都十分容易發生污染[2-3]，因此對沙門氏菌的檢驗事關重大。目前常用的檢測方法有傳統方法(如國家標準、行業標準、FDA、AOAC、FSIS、ISO、加拿大官方食品微生物分析方法)、儀器檢測法(如VIDAS、BAX)、商品化生化鑒定系統(VITEK GNI+、API 20E)[4-5]。筆者分別采用國標GB4789.4—2016、基于迪澳生物核酸恒溫擴增熒光檢測技術的致病菌快速檢測系統、MICRO FAST沙門氏菌快速檢測卡的方法檢測食品中的沙門氏菌，比較3種檢測方法的檢測效果和檢出率。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1試驗陽性菌種。腸炎沙門氏菌(CICC21513)來自中國工業微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2國標GB4789.4—2016方法。緩沖蛋白胨水(BPW)、四硫磺酸鈉亮綠培養基(TTB)、亞酸鹽胱氨酸增菌液(SC)、亞硫酸鉍瓊脂(BS)、三糖鐵瓊脂(TSI)、XLD培養基、HE培養基、沙門顯色培養基、沙門氏菌生化鑒定試劑盒、沙門氏菌O多價抗原、H多價抗原均來自北京陸橋技術有限責任公司。

1.1.3基于迪澳生物核酸恒溫擴增熒光檢測技術的致病菌快速檢測系統。致病菌核酸恒溫擴增熒光檢測儀、移液器、混勻器、恒溫金屬浴、高速離心機、迪澳沙門氏菌核酸檢測系列試劑盒均由廣州迪澳生物科技有限公司提供。

1.1.4MICRO FAST沙門氏菌快速檢測卡。快速檢測卡由北京良潤生物科技有限公司提供。

1.2測試步驟

1.2.1國標GB 4789.4—2016方法[6]。取檢樣25 g，加入225 mL緩沖蛋白胨水于均質袋內，均質后于(36±1)℃培養24 h，然后分別移取1 mL轉種于10 mL四硫磺酸鈉亮綠培養基(TTB)，于42 ℃培養18～24 h；同時，另取1 mL轉種于10 mL 亞酸鹽胱氨酸增菌液(SC)內，于(36±1)℃培養18～24 h。取增菌液1環，劃線接種于一個亞硫酸鉍瓊脂(BS)、XLD培養基、HE培養基、沙門顯色培養基上，于(36±1)℃分別培養18～24 h或40～48 h(BS)；觀察在各培養基上的菌落形態，如發現疑似菌，純化后做生理生化鑒定。

1.2.2基于迪澳生物核酸恒溫擴增熒光檢測技術的致病菌快速檢測系統[7-8]。取檢樣25 g，加入225 mL緩沖蛋白胨水于均質袋內，均質后于(36±1)℃培養24 h得增菌液。用快速提取試劑盒提取增菌液中沙門氏菌的核酸，將處理液滴加于檢測試劑中混勻，使用迪澳恒溫PCR檢測儀進行檢測，自動判讀結果。

1.2.3MICRO FAST沙門氏菌快速檢測卡[9]。取檢樣25 g，加入225 mL緩沖蛋白胨水于均質袋內，均質后于(36±1)℃培養24 h得增菌液。移取1 mL增菌液到無菌試管中，于沸水中加熱10 min，冷卻后使用。打開檢測卡，在加樣孔中垂直滴加3～4滴(約100 μL)已滅菌的待檢樣品，等待8～10 min后，觀察檢測卡中部的檢視窗的結果。30 min后顯示結果無效。陽性反應：C、T線均顯色。陰性反應：C線顯色，T線不顯色。失效反應：C線不顯色，測試失敗或檢測卡失效。

2 結果與分析

2.1傳統檢測方法檢測結果檢測的63份食品樣品中，通過傳統國際GB4789.4—2016方法檢測，共檢出陽性樣品2份。2份樣品經前增菌、増菌、分離純化后的菌種在培養基上的形態符合沙門氏菌，其生理生化試驗以及血清凝集試驗均滿足沙門氏菌的性狀，判定檢測結果陽性。

2.2快速檢測方法結果基于迪澳生物核酸恒溫擴增熒光檢測技術的致病菌快速檢測系統和MICRO FAST沙門氏菌快速檢測卡的方法都檢出了3份陽性樣品。

2.3檢測結果的比較從表1可看出，檢測的63份食品樣品中，用傳統國標GB 4789.4—2016方法檢出2份陽性樣品，檢出率3.2%；而基于迪澳生物核酸恒溫擴增熒光檢測技術的致病菌快速檢測系統和MICRO FAST沙門氏菌快速檢測卡的方法均檢出了3份陽性樣品，檢出率均為4.8%。由此可見，基于迪澳生物核酸恒溫擴增熒光檢測技術的致病菌快速檢測系統和MICRO FAST沙門氏菌快速檢測卡的方法與傳統國標方法相比較具有較高的靈敏性和特異性。

表1 3種檢測方法檢測結果比較

2.4檢測方法優缺點比較從表2可以看出，3種檢測方法各有優缺點，基于迪澳生物核酸恒溫擴增熒光檢測技術的致病菌快速檢測系統和MICRO FAST沙門氏菌快速檢測卡的方法與傳統國標方法相比較具有操作方便、快速靈敏的優點，可以用于大批量食品中沙門氏菌的快速檢測和初篩；而國標GB 4789.4—2016方法在國際上被廣泛承認，是鑒定沙門氏菌的基準方法。

表2 3種檢測方法優缺點比較

2.5對于國標中沙門氏菌檢測過程的思考

(1)前增菌和二次增菌都是必不可少的過程。食品中的沙門氏菌含量一般都很少并且會有多種細菌同時存在的情況，前增菌可以使受傷菌得到修復而增菌可以抑制一些雜菌的生長，所以用前增菌和增菌分別進行篩選和培養，可以增加后期分離培養的檢出率。

(2)分離培養中應注意當不存在典型的或可疑的沙門氏菌菌落時，按如下步驟檢驗非典型的沙門氏菌菌落：①HE和XLD。非典型的沙門氏菌在HE和XLD瓊脂上呈黃色菌落，帶或不帶黑色中心。HE和XLD平板經(24±2)h培養后，沒有典型的沙門氏菌菌落，則挑取2個或更多個非典型的沙門氏菌菌落。②BS瓊脂。某些非典型菌株產生綠色菌落，其周圍培養基稍微或不呈暗色。如果BS平板培養(24±2)h后，沒有出現典型菌落，則不挑取任何菌落讓平板繼續培養(24±2)h。如果經(48±2)h培養后，仍沒有典型或可疑菌落出現，則挑取2個或更多個非典型的菌落。

(3)TSI要制備成高柱斜面，有助于結果判讀，試驗時應先劃線再穿刺，先穿刺再劃線會由于含菌量太高，如果產H2S變黑，難以觀察底層的產酸現象，并且如果產氣較多的話培養基會被頂出很高更有甚者可能會頂開試管塞。典型沙門氏菌在TSI上斜面呈紅色，底端呈黃色，有氣體產生，90%形成H2S，瓊脂變黑。但對于乳糖陽性的沙門氏菌斜面也呈黃色，因此不能僅僅根據三糖鐵培養的結果就確認沙門氏菌。

(4)目前沒有一種培養基能準確無誤地篩選出沙門氏菌，因此必須選擇多種選擇性培養基同時進行篩選，顯色培養基只是綜合選擇性更強，試驗人員不能只在選擇性培養基和TSI 特征符合而沒有把關鍵的生化反應和血清學鑒定完成的情況下就報結果，這樣很可能導致結果假陽性。

(5)血清學鑒定是沙門氏菌檢驗中的重要鑒定方法，包括菌體抗原(O)鑒定、鞭毛抗原(H)鑒定和Vi抗原鑒定。血清檢測時要使用24 h內的純菌，在規定時間內觀察結果，并做自凝試驗。凝集不好的室溫(不要放冰箱)放置1～2 d或者傳代一次再凝集，可能凝集的情況會好些。如果實驗室條件許可建議購置進口血清(以泰國和丹麥血清為佳)，如果用國產血清盡量同時使用2種廠家產品互相驗證。

(6)沙門氏菌結果判定應該以生化試驗結果為主，并在此基礎上進行血清學判定。直接用多價血清進行試驗而不進行生化試驗是絕對不可取的。因為血清學的原理是抗原抗體結合，非沙門氏菌的微生物也有可能帶有沙門的類似抗原，這樣的操作可能會導致假陽性，因此在做鑒定時必須先進行生化試驗，再在生化試驗的基礎上進行血清學鑒定。

(7)如果只需要鑒定某個菌株是否屬于沙門氏菌，那只需要做O多價和H多價血清就可以了(大多數食源性沙門氏菌凝集A-F群O多價)。如果要鑒定某個菌株具體是什么沙門氏菌，那就需要進行血清學分型試驗，從多價血清一直做到O抗原和H抗原的單因子，然后參照《GB 4789.4—2016 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》附錄B的表格查找對應的沙門氏菌名。

(8)在做血清學鑒定時，O多價血清如果沒有凝集并不能直接判定為陰性，因為還要考慮Vi抗原的影響。Vi抗原屬于K抗原群會阻隔O抗原和相應抗體的結合，所以當Vi抗原存在時，O多價血清是不會凝集的，因此必須去除Vi抗原的影響。具體方法是挑取菌苔于1 mL生理鹽水中做成濃菌液，于酒精燈火焰上煮沸后再檢查如果還是不凝集，才能判定為陰性。

3 結論與討論

該研究分別采用國標GB 4789.4—2016、基于迪澳生物核酸恒溫擴增熒光檢測技術的致病菌快速檢測系統、MICRO FAST沙門氏菌快速檢測卡的方法檢測食品中的沙門氏菌，比較3種檢測方法的檢測效果和檢出率。結果顯示，檢測的63份食品樣品中，用國標GB 4789.4—2016方法檢出2份陽性樣品，檢出率3.2%，檢測時間至少為6 d；而基于迪澳生物核酸恒溫擴增熒光檢測技術的致病菌快速檢測系統和MICRO FAST沙門氏菌快速檢測卡的方法均檢出了3份陽性樣品，檢出率均為4.8%，并且可以在30 h內出結果。從靈敏度和特異性角度來看，基于迪澳生物核酸恒溫擴增熒光檢測技術的致病菌快速檢測系統和MICRO FAST沙門氏菌快速檢測卡的方法與傳統國標方法相比較具有快速靈敏的優點；從檢測周期來看，國標GB 4789.4—2016微生物培養法中培養時間較長，最短的檢測周期為6 d，而基于迪澳生物核酸恒溫擴增熒光檢測技術的致病菌快速檢測系統和MICRO FAST沙門氏菌快速檢測卡的方法2 d即可出結果，可以用于大批量食品中沙門氏菌的快速檢測和初篩，也可以作為國標方法的有效補充。