基于網絡藥理學的苦丁茶主要活性成分及藥理作用機制分析

霍麗妮，陳 睿，鐘振國*，李培源，盧澄生

(1.廣州中醫藥大學，廣東廣州 510006；2.廣西中醫藥大學，廣西南寧 530001)

苦丁茶(IlexKudingchaC.J.Tsing)是冬青科冬青屬苦丁茶種常綠喬木，俗稱菠蘿樹、大葉茶和茶丁等，是我國南部及西南部民間傳統的藥用植物，具有清熱解毒、殺菌消炎、健胃消積、止咳化痰、生津止渴、提神醒腦、明目益智和抗輻射、抗衰老、活血脈、調節血脂等功效[1]，素有“保健茶”“美容茶”“減肥茶”“降壓茶”“益壽茶”等美稱，可作為新型保健藥開發，具有很廣闊的前景。苦丁茶化學成分較復雜，主要含有三萜及苷類、黃酮類、多酚類、氨基酸、揮發油以及多糖等多種有效物質成分[2]。因中草藥具有多成分、多靶點及相互協同等特點，導致研究苦丁茶活性成分及潛在的藥用靶點存在很大困難。

2007年Hopkins提出網絡藥理學理論[3]，它是基于系統生物學的理論，對生物系統的網絡分析，選取特定信號節點(Nodes)進行多靶點藥物分子設計的新學科。網絡藥理學強調藥物也可以是多成分-多靶標-多疾病的作用方式，通過對信號通路的多途徑調節，提高藥物的治療效果，降低毒副作用，從而提高新藥臨床試驗的成功率，節省藥物的研發費用。目前，已有學者將網絡藥理學用于預測和辨識中藥活性成分群、作用靶點及闡明作用機制[4]。因此，筆者基于TCMSP數據庫，運用網絡藥理學方法，建立藥物-靶點-疾病網絡，結合基因本體GO(gene ontology)和生物通路(pathway)功能富集分析，對活性成分的作用靶點、相關疾病以及生物通路等進行綜合分析，以期揭示苦丁茶的主要活性成分及其藥理作用機制。

1 材料與方法

1.1化學成分收集與活性成分篩選采用TCMSP數據庫，通過TCMSP數據庫收集苦丁茶的化學成分，共收集苦丁茶化學成分94個。以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)和類藥性(drug-like，DL)評價成分的體內過程，選擇OB≥28%和DL≥0.18 作為篩選條件，篩選活性成分。

1.2活性成分與靶點的作用數據收集根據篩選得出的活性成分在TCMSP平臺中找出相對應的靶點，將靶點數據進一步通過UniProt數據庫、TTD、drugbank數據庫確認。選擇物種為人(Human)作為研究對象，最終得到苦丁茶活性成分的作用靶點182個。

1.3網絡構建和分析使用可以圖形化顯示并可進行分析和編輯的軟件Cytoscape(版本3.6.1)，將候選化合物與其潛在的靶點蛋白生成一個體現藥物靶點相互作用的網絡圖，并根據得出的潛在靶點在TCMSP平臺中找出相關的疾病(種)，生成靶點疾病相互作用網絡圖，進而可生成化合物疾病相互作用網絡圖。

1.4GO及pathway富集分析為了揭示互作蛋白在基因功能上的富集情況，將CTD在線分析平臺篩選182個靶點蛋白導入Funrich軟件(版本3.1.3)，通過軟件的Gene enrichment模塊進行 GO及 pathway 富集分析。

2 結果與分析

2.1活性化合物篩選如表1所示，以OB≥28%和DL≥0.18作為篩選條件得到13個活性成分。

表1 苦丁茶的活性化合物

2.2活性成分-靶點網絡分析將篩選出的13個活性成分和靶點相連構建活性成分-靶點(components-targets，C-T)網絡圖，如圖1所示，其中包含191個節點nodes(9個活性成分和182個靶點)；V形節點代表活性成分，圓形節點節點代表靶點，而邊則表示活性成分與靶點的相互作用關系。在網絡中，節點的網絡度和介數值與節點的重要性成正比，節點的大小也反映度的大小，如表2所示，其中黃酮類MOL000098(槲皮素)度數最大(154個靶點)，為網絡的中心節點；其次是黃酮類MOL000422(山柰酚)有63個靶點、萜類MOL000358(β-谷甾醇)有38個靶點、黃酮類MOL006505(表兒茶素)有32個靶點。靶點較多的成分可能在苦丁茶發揮藥理功能中起重要作用，從表2可以看出苦丁茶的良好生物活性主要與黃酮類化合物或萜類有關。文獻報道也驗證了預測結果，黃酮類化合物槲皮素、山柰酚、表兒茶素均被證明具有降壓、降血脂、抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒等作用[5-8]，此外，β-谷甾醇也被證明具有抗菌、抗炎、抗癌、抗氧化、抗高血脂、抗動脈硬化、抑制血小板聚集等廣泛的藥理活性[9]。

在靶點上，G1氨基丁酸A型受體α1(GBRA1)、前列腺素H2(PGH2)、重組蛋白PKAca、前列腺素H1(PGH1)、類固醇受體激活蛋白2(NCOA2)、熱休克蛋白90B(HS90B)、重組人胱天蛋白酶(CASP3)的度值較高，它們分別與7、6、5、5、5、5、5個活性化合物相互作用(圖1和表2)，表明活性成分在靶點上具有協同性，是苦丁茶發揮整體藥效作用的關鍵靶標。在靶點數目上，以黃酮類活性成分靶點最多(220個)，其次是萜類(44個)和酚類(43個)，說明這些成分之間有著較強的協同作用，故而貢獻多維藥理活性。

表2 苦丁茶中的化學成分-靶向蛋白的網絡度和介數值

2.3靶點-疾病及主要活性成分-疾病網絡分析通過CTD在線分析平臺將篩選182個靶點與疾病相連接構建靶點-疾病(targets-diseases，T-D)網絡圖，如圖2所示，其中包含348個節點nodes(82個蛋白靶點和266種疾病)。266種疾病中主要包括腫瘤(50種)、心腦血管疾病(49種)、炎癥(19種)和微生物感染(10種)等幾大類。

為了直觀地反映活性成分與疾病之間的關系，選擇相關度高的活性化合物和靶點與相關疾病構建C-T-D網絡(疾病節點只顯示degree≥6)。從圖3可以看到有超過50%的疾病與腫瘤、炎癥和心腦血管疾病相關。目前，苦丁茶已被證實可治療原發性高血壓及心腦血管疾病等的頭昏、頭痛、胸悶、乏力、失眠，降低血壓、血脂，改善血液流變學狀態的作用，具有很好的開發利用前景[10]。研究表明，苦丁茶具有較好的體外抗MCF-7人乳腺癌細胞活性，其水提物(200 μg/mL)抑制率達81%，并且研究還發現能減弱炎癥相關因子NF-kB、iNOS和COX-2的表達，展現了良好的抗炎特性[11]。此外，苦丁茶黃酮還可通過caspases活化誘導人HSC-3口腔癌細胞凋亡[12]。這些研究均與網絡分析的結果一致。

2.4通路富集分析和構建蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡將CTD在線分析平臺篩選182個靶點蛋白導入Funrich軟件進行了GO和pathway富集分析。GO可分為分子功能、生物過程和細胞組成3個部分。GO富集分析可以粗略了解差異基因富集在哪些生物學功能、途徑或者細胞定位，通過GO富集分析(P<0.05)，如圖4所示，分子功能、細胞組分及生物過程3個部分分別顯著富集到20、65和13個條目。分析結果表明，其分子功能與氧化還原酶活性和細胞因子活性相關性最大；細胞組分與細胞外隙和細胞外基質相關性最大；生物過程與能量途經和新陳代謝相關性最大。

圖1 苦丁茶中的活性成分-靶點網絡圖Fig.1 The components-targets network

圖2 靶點-疾病網絡圖Fig.2 The targets-diseases network

對差異基因進行pathway分析，可以了解試驗條件下顯著改變的代謝通路，在機制研究中顯得尤為重要。通過pathway分析(P<0.01)，富集到283條pathway，圖5顯示最為顯著的6條pathway分析結果，包括AP-1轉錄因子網絡、整合素連接激酶信號、由VEGFR1 and VEGFR2介導的信號事件、VEGF and VEGFR信號網絡、LKB1 信號事件以及IFN-γ通路。這些信號通路與乳腺癌、黑色素瘤等癌癥以及心腦血管疾病有密切關系。

圖4 基因本體富集分析Fig.4 Enrichment analysis by gene ontology

圖5 生物通路富集分析Fig.5 Enrichment analysis by biological pathway

3 結論

綜上所述，該研究應用網絡藥理學方法初步研究了苦丁茶的活性成分、靶點、相關疾病及其疾病系統和作用生物通路，共發現苦丁茶活性成分共13個，進一步通過網絡分析篩選，得到9個主要活性成分，作用靶點182個，關聯通路6條，治療疾病262種，主要用于治療癌癥、炎癥、心腦血管等疾病，由此可見苦丁茶治療疾病的廣泛性，具有多成分-多靶標-多通路的特點。靶點GBRA1、PGH2、PKAca、PGH1、NCOA2、HS90B、CASP3互作的相關活性成分較多，可能是苦丁茶活性成分發揮藥效作用的關鍵靶標。相關的通路均與癌癥和心腦血管疾病有關。這些研究結果從網絡藥理學角度揭示了苦丁茶的主要活性成分及其作用靶點、主要疾病類型及關鍵生物通路，為進一步研究其藥理作用機制奠定了良好基礎。