游泳運動對大鼠膝關節骨關節炎內質網應激PERK表達的影響

謝冰，肖樂，劉超，李元，孔瑛

骨關節炎(osteoarthritis，OA)是一種常見的慢性進行性肌肉骨骼疾病，以關節軟骨退變，軟骨下骨硬化，關節邊緣骨贅形成為主要特征，使人們的生活質量下降，給家庭、社會帶來了嚴重的負擔。在骨關節炎的發生發展過程中，軟骨細胞的凋亡起了重要的作用[1-2]。骨關節炎病變過程中，軟骨細胞凋亡顯著增多，軟骨細胞大量減少，同時伴有細胞外基質降解，最終導致關節軟骨的退變[3]。引起軟骨細胞凋亡的原因有很多種，而通過內質網應激介導的軟骨細胞凋亡是目前研究的熱點[4]。已有大量的研究證明骨關節炎患者及大鼠均可見內質網應激引起的軟骨細胞的凋亡[5-6]。而蛋白激酶樣內質網激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)被認為是內質網應激發生的標志[7]。通過研究骨關節炎內質網應激PERK的表達情況，可進一步明確PERK在關節軟骨退變中的作用，并為骨關節炎的防治提供新的方向及新靶點。

目前治療骨關節炎的方法有很多種，而游泳運動被認為對骨關節炎的治療起重要作用[8]。然而目前對于游泳對骨關節炎的具體作用機制還不明確。本研究通過制造大鼠膝關節骨關節炎模型，同時進行游泳訓練，探討游泳對內質網應激PERK表達的影響，明確游泳能否通過影響內質網應激PERK的表達，減少軟骨細胞凋亡，從而保護關節軟骨，防止關節軟骨退化，進而明確游泳的治療效果，為指導進行正確的康復訓練提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 ①實驗動物與分組：實驗動物由湖南省人民醫院動物實驗室提供的雄性健康Sprague-Dawley(SD)大鼠24只，6～8周齡，體質量220～260g。各鼠分籠飼養，進食及飲水符合實驗動物標準。適應性飼養3d后，采用隨機數字表法將大鼠分為空白對照組(A組)、假手術組(B組)，模型對照組(C組)和游泳運動組(D組)，每組6只。大鼠籠內自由活動，所有動物均選取右膝關節為實驗側。②主要實驗儀器與試劑： 游泳池(由湖南省人民醫院動物實驗中心提供，長70cm，寬70cm，高100cm)、PERK抗體[兔抗大鼠，濃度(1∶50)，貨號：Sc-13073,Santa Cruz生物公司]、二抗試劑盒：rabbit ABC staining system[濃度約為1ug/ml，(貨號：Sc-2018,Santa Cruz生物公司)]。

1.2 方法 ①骨關節炎模型的建立：稱重后，10%水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射麻醉大鼠，備皮消毒后沿髕韌帶內側緣切開皮膚，顯露膝關節后將髕骨外翻，打開關節囊，分離前交叉韌帶并剪斷，行抽屜實驗驗證是否成功。分離內側半月板并切除內側前部半月板。生理鹽水沖洗關節腔后逐層縫合，絡合碘擦洗傷口，手術當天及術后第1、2天肌肉注射8萬U青霉素預防感染。假手術組只打開關節腔暴露前交叉韌帶及半月板后即縫合。待 SD大鼠清醒后按編號分籠，讓其自由活動及進食，同時觀察大鼠一般情況并記錄。②分組處理：A組，籠內自由活動8周，不予特殊處理；B組，假手術后籠內自由活動8周，不予治療；C組，造模后籠內自由活動8周，不予治療；D組，造模籠內自由活動4周后進行游泳訓練，每日1次，每次30min，連續4周。

1.3 標本采集與處理 ①標本的采集與處理：治療結束后斷頸法處死大鼠，切開實驗側膝關節，顯露關節軟骨，觀察關節內軟組織、滑膜、關節液、關節軟骨等情況，并進行大體評分。觀察完畢后，取內側脛骨端軟骨下2cm固定、脫鈣、包埋切片后作甲苯胺藍、HE染色及免疫組織化學染色以進行組織學觀察。②軟骨病理學觀察：打開關節腔后肉眼觀察脛骨關節軟骨面的大體形態，并按照大體評分標準進行評分[9]，評分越高表明關節軟骨損傷越重。③組織學觀察：觀察HE染色及甲苯胺藍染色結果，評價軟骨形態、細胞數量、基質染色、及潮線完整性等情況，采用雙盲法對標本按關節軟骨光鏡改良Mankin評分標準[10]進行評分，評分越高，表明關節軟骨損傷越重。④免疫組織化學觀察：進行免疫組織化學染色，石蠟切片60℃恒溫烤箱烘烤2h，常規脫蠟至水，3%的過氧化氫滅活內源性的過氧化物酶；滴加胃蛋白酶，37℃孵育；滴加透明質酸酶，37℃孵育；山羊血清封閉，室溫孵育，滴加PERK一抗(1∶50)50μl，4℃冰箱過夜，復溫后滴加生物素化二抗工作液50μl，37℃溫箱孵育；辣根過氧化物酶標記的鏈卵白素工作液37℃孵育；二氨基聯苯胺染色，鏡下控制顯色時間；蘇木素復染，脫水，透明，中性樹脂封片。觀察免疫組織化學染色結果，用中倍(×200)鏡觀察軟骨細胞PERK的胞漿著色情況。PERK陽性細胞表現為軟骨細胞胞漿呈棕黃色染色。計算陽性率：采用IPP(Image-Pro Plus6.0)圖像分析軟件進行分析，測其平均光密度值。每張切片中倍(×200)鏡下隨機取5個視野，分別對各組之間的平均光密度值進行比較。

2 結果

2.1 大體觀察及評分 ①大體觀察。A組：軟骨表面色澤明亮，為半透明狀，光滑，無裂隙、潰瘍及破損，輪廓清晰，關節滑膜平整光滑，關節液清亮，關節內無粘連(圖1-a)。B組：軟骨表面色澤較正常組稍暗，為半透明狀，光滑，無裂隙，關節滑膜少有粘連，關節液稍黃，關節內有粘連(圖1-b)。C組：軟骨表面呈灰白色，不透明，軟骨面粗糙，凹凸不平，軟骨面可見明顯的裂隙、糜爛、潰瘍，軟骨下骨暴露，部分關節邊緣可見骨贅形成。關節囊增厚，滑膜不同程度增生、粘連，部分可見滑膜囊腫。關節液渾濁，色澤較黃，關節腔內粘連(圖1-c)。D組：軟骨表面色澤稍暗，透明度下降，軟骨表面稍有不平，可見裂隙、潰瘍及破損，無骨贅及軟骨下骨暴露。滑膜稍有增生，未見囊腫。關節液稍黃，關節腔內有粘連(圖1-d)。②大體評分：B組與A組比較差異無統計學意義； C、D組與A組比較評分明顯增高(P<0.05)；D組與C組比較評分降低(P<0.05)。見表1。

圖1a-d 膝關節軟骨肉眼觀察

表1 4組大鼠膝關節軟骨大體評分比較分，

與A組比較，aP<0.05；與C組比較，bP<0.05

2.2 關節軟骨光鏡下觀察及改良Mankin評分 ①HE染色及甲苯胺藍染色。A組：軟骨表面光滑，細胞排列有序，數目正常，HE染色軟骨基質著色均勻，潮線完整，甲苯胺藍著色深藍，染色均勻，無基質失染(圖2-a，圖3-a)。B組：軟骨表面光滑，軟骨細胞分布均勻，排列有序，形態正常，甲苯胺藍著色染色稍有不均，無基質失染(圖2-b，圖3-b)。C組：軟骨表面不規則，部分區域有絨毛，有裂隙，細胞排列紊亂，數目減少，集簇現象明顯，周圍出現大小不等的空陷窩，潮線模糊、斷裂，甚至消失，甲苯胺藍染色全層基本失染，尤其以表層為重(圖2-c，圖3-c)。D組：軟骨表面較規則，軟骨細胞分布欠均勻，排列稍紊亂，可見少量軟骨細胞簇，細胞數目稍減少，潮線較完整，甲苯胺藍染色稍有不均，表中層可見基質失染(圖2-d，圖3-d)。②各組關節軟骨改良Mankin評分： B組與A組比較差異無統計學意義；C、D組與A組比較評分明顯增高(P<0.05)；D組與C組比較評分明顯降低(P<0.05)。見表2。

圖2a-d 各組大鼠軟骨HE染色(×100)

圖3a-d 各組大鼠軟骨甲苯胺藍染色(×100)

表2 4組大鼠膝關節軟骨改良Mankin評分比較分，

與A組比較，aP<0.05；與C組比較，bP<0.05

2.3 免疫組織化學染色結果 ①軟骨細胞PERK的胞漿著色情況。PERK陽性細胞表現為軟骨細胞胞漿呈棕黃色染色。采用IPP圖像分析軟件進行分析，測其平均光密度值。A組：表層偶見少量PERK陽性細胞(圖4-a)。B組：表層可見少量的PERK陽性細胞(圖4-b)。C組：全層有散在分布的PERK陽性細胞,尤以表層及中層多見(圖4-c)。D組：表中層可見散在的PERK陽性細胞，較C組少(圖4-d)。②各組大鼠膝關節軟骨PERK平均光密度值比較：B組與A組比較，PERK陽性細胞數差異無統計學意義； C、D組與A組比較，PERK陽性細胞數明顯增高(P<0.05)；D組與C組比較，PERK陽性細胞數降低(P<0.05)。見表3。

圖4a-d 各組大鼠軟骨PERK免疫組化染色(×200)

表3 4組大鼠膝關節軟骨PERK平均光密度值比較像素,

與A組比較，aP<0.05；與C組比較，bP<0.05

3 討論

隨著我國社會人口的老齡化，骨關節炎引起疼痛及活動受限給社會經濟帶來了很大的負擔，目前對于人類骨關節炎的發病機制尚不明確，且無有效的治療方法，因此研究有效的治療骨關節炎的方法越來越迫切。目前骨關節炎的常用的治療方法包括：運動治療、藥物治療、理療、手術等[11-12]，而水中運動被強烈推薦用于骨關節炎的治療[8]。游泳運動是一種常見的水中運動，能提高心肺功能及身體素質，延緩關節退變[13-14]。同時由于水的浮力可減少運動時由于體重因素造成的對關節的不利影響，與跑步，騎車等陸地運動相比，游泳時關節軟骨所承受的壓力更小，關節軟骨損傷更小[15]。然而目前對于游泳對骨關節炎的具體作用機制還不明確。基于上述原因，我們通過制造大鼠骨關節炎模型，研究游泳訓練對關節軟骨退化的影響。

研究證明內質網應激介導的軟骨細胞凋亡在骨關節炎的發生發展過程中起了重要的作用[1-2]。發生內質網應激時，PERK通路是最先激活也是最重要的通路[16-17]。PERK激活后，阻斷錯誤折疊蛋白的合成，減少了內質網的負擔,維持了內質網平衡，使內環境恢復穩態，挽救損傷的細胞，促進細胞存活[18]。但是太強或者太長的內質網應激會激發細胞內的凋亡傳導通路，使細胞發生凋亡。已有研究證明，在OA的關節軟骨中，PERK的表達增加，且表達水平與骨關節炎嚴重程度密切相關，隨著OA程度的增加而增加[5]。雖然PERK在骨關節炎中的作用已經得到了證實，但能否通過影響PERK的表達對骨關節炎起到治療作用仍需要充分的研究。本研究中，通過檢測PERK探討游泳運動能否通過影響PERK的表達而對骨關節炎關節軟骨的退化起保護作用，從而對骨關節炎起治療作用。

本研究證實了內質網應激中PERK的表達可能與骨關節炎的發生發展密切相關。本研究結果顯示： A、B組僅有少量PERK的表達，而C組PERK表達明顯增多，與A組相比，差異有統計學意義，而C組的實驗結果均顯示關節軟骨的退化程度較A組明顯嚴重，說明前交叉韌帶切斷聯合內側半月板部分切除能成功制造骨關節炎模型，引起關節軟骨的損害，且骨關節炎的發生可能與PERK的表達增加密切相關。提示骨關節炎大鼠中可能存在內質網應激，PERK表達增加，使軟骨細胞發生凋亡，從而使關節軟骨退化。

本研究認為游泳運動可能通過降低PERK的表達對骨關節炎起治療作用。本實驗結果顯示：游泳運動治療后，D組與C組相比，PERK的表達水平明顯下降，而D組的實驗結果均顯示關節軟骨的退化程度較C組明顯減輕，提示游泳可以延緩關節軟骨的退變，對骨關節炎起治療作用，其作用機制可能為降低內質網應激，減少PERK表達，減少相關性軟骨細胞凋亡，從而保護軟骨細胞，減輕關節軟骨退化。但是游泳運動具體如何使PERK表達下降，而PERK通過何種途徑影響軟骨細胞凋亡、防止軟骨退化還不得而知。D組與A組比較，大體評分、改良Mankin評分、PERK的表達均升高，差異有統計學意義，提示每天一次，每次30min，連續28d的游泳訓練尚不能使骨關節炎關節軟骨的損害恢復正常，使PERK的表達降至正常。因此能否通過延長每次訓練的時間及治療周期以改善治療效果還值得進一步研究。

通過本研究發現，游泳運動可對骨關節炎可起治療作用，其作用可能是通過降低內質網應激PERK的表達實現。然而本實驗僅選擇了每日1次，1次30min，總共4周的游泳運動為實驗組，對于更多不同的游泳運動時間、運動頻率、運動周期對關節軟骨的影響等問題需在今后的實驗中進一步探討研究，另外，由于實驗人力、物力、財力等方面的原因，同時動物實驗過程中死亡或其他意外發生較多，本實驗樣本量較小，今后的實驗可擴大樣本量，同時從關節液、滑膜、軟骨下骨及血清學指標的變化等多方面評定、驗證療效，使結果更具有說服力。因內質網應激發生PERK表達增加后具體的作用通路，以及通過何種凋亡途徑、如何影響軟骨細胞的凋亡也沒有在實驗中進行研究，在以后的實驗中我們可從基因水平、細胞水平進一步探討其具體作用機制。